ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДОГЕННОГО РЕТРОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА HERV – E λ 4 – 1 ПРИ ПРИЖИЗНЕННОМ ВВЕДЕНИИ ЕГО ПРОТЕИНА РЕГИОНА ENV ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЖИВОТНЫМ

Гольдина И.А.¹, Сафронова И.В.², Гайдуль К.В.³

¹Научный сотрудник;  ²научный сотрудник, кандидат медицинских наук;     ³ведущий научный сотрудник, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск

ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДОГЕННОГО РЕТРОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА HERV – E λ 4 – 1 ПРИ ПРИЖИЗНЕННОМ ВВЕДЕНИИ ЕГО ПРОТЕИНА РЕГИОНА ENV ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЖИВОТНЫМ

Аннотация

Представленные в настоящей работе результаты свидетельствуют  о  наличии иммуностимулирующих свойств у эндогенного ретровируса человека I класса HERV – E λ 4 – 1, на основании влияния синтетического пептида, гомологичного аминокислотной последовательности протеина региона env данного ретровируса на морфометрические параметры органов иммунной системы, а также функциональную активность иммунокомпетентных клеток, в частности, пролиферативный потенциал и формирование клеточного иммунного ответа.

Ключевые слова: эндогенные ретровирусы, олигопептид.

Goldina I.A.¹, Safronova I.V.², Gaidul K.V.³.

¹Scientific researcher; ²scientific researcher, PhD; ³professor, MD, Research Institute of Clinical Immunology Siberian Branch of the  Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk

HUMAN ENDOGENOUS RETROVIRUS HERV - E λ 4 – 1 IMMUNOTROPIC PROPERTIES UNDER THE INTRAVITAL ESTABLISHING OF ITS ENV REGION PROTEIN TO EXPERIMENTAL ANIMALS

Abstract

Presented data indicate the immunostimulatory properties of the human endogenous class I retrovirus HERV - E λ 4 - 1 on the basis of the influence of a synthetic peptide homologous to the amino acid sequence of env region protein of the retrovirus on the immune system’s organs morphometric parameters as well as the functional activity of immunocompetent cells, in particular, the proliferative potential and the formation of a cellular immune response.

Keywords: endogenous retroviruses, oligopeptide.

Введение.

Эндогенные ретровирусы (ЭР) представляют собой мобильные элементы генома и являются интегрированными в виде провируса формами экзогенных ретровирусов, которые наследуются, согласно законам Менделя [5, 23, 37].  Наличие мутаций в структурных генах большинства ЭР предотвращает их способность к репликации [24]. В то же время, некоторые ЭР способны к активации и продукции вирусных протеинов [11, 22, 33]. Предполагается, что влияние различных факторов внешней среды, в частности, суперинфекции, эпигенетический статус генома – гипометилирование ДНК, деацетилирование гистонов, воздействие внутриклеточных факторов транскрипции вызывают экспрессию ЭР, и, в ряде случаев, продукцию вирусных белков [8, 9].

Несмотря на интенсивное изучение, до настоящего времени множество аспектов проблемы исследования функций эндогенных ретровирусных последовательностей в геноме человека остаются невыясненными [7]. Так, было обнаружено, что ЭР ассоциированы с различными заболеваниями человека – рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, диабетом 1 типа, рядом онкологических заболеваний, однако механизмы их участия в патогенезе данных заболеваний окончательно не установлены [6, 26, 31, 32, 36, 38]. Предполагается, что биологические эффекты ЭР реализуются посредством инсерционного мутагенеза, взаимодействия с экзогенными вирусами, изменения экспрессии генов, а также через выработку белков, обладающих иммунотропными свойствами [16, 18, 27, 32]. В частности, был описан рекомбинантный гептадекапептид (CKS – 17), соответствующий высококонсервативному региону гидрофобного трансмембранного протеина р15Е эндогенного ретровируса мышиной лейкемии Молони,  ретровируса лейкемии семейства кошачьих, обезьян, коров, ретровируса Т – клеточной лейкемии человека I и II типов [10, 11],  для которого характерны иммуносупрессорные свойства, в том числе,  подавление продукции γ – ИФН, ИЛ – 2 и ФНО – ά [21, 25].  С другой стороны, рекомбинантный пептид ЭР человека класса HERV – W, как было обнаружено, стимулирует продукцию ИЛ – 2,  ИФН – γ, ФНО - ά [32].  Некоторые экзогенные ретровирусные протеины человека и животных, в частности продукты гена env, обладают и нейропатогенными свойствами [30].

Известно, что при рассеянном склерозе, хроническом аутоиммунном заболевании центральной нервной системы, в основе которого лежит иммуноопосредованная деструкция миелина с последующей мультифокальной демиелинизацией нервных волокон и, как следствие этого, моторными, сенсорными и когнитивными нарушениями у больных,  происходит повышение экспрессии некоторых ЭР в головном мозге и мононуклеарных клетках крови [12, 19, 35].

Согласно данным литературы [28, 29], а также полученным нами ранее данным, ЭР человека I класса HERV – E λ 4 – 1 ассоциирован с рядом аутоиммунных заболеваний – системной красной волчанкой, рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, причем частота и уровень его экспрессии в мононуклеарных клетках крови (МНК) больных коррелирует с активностью заболевания [1, 2, 3, 34].    Данный ЭР характеризуется  высокой степенью гомологии базовых последовательностей нуклеотидов в регионах gag, pol и env с вирусом мышиной лейкемии Молони.  HERV – E  λ 4 – 1 репликационно компетентен, способен к продукции белков, его аминокислотная последовательность (8,8 кб) содержит открытые рамки считывания в регионах gag и env. Антитела к HERV – E λ 4 – 1 в сыворотке крови здоровых индивидуумов не обнаруживаются [28, 39 ].

На основании вышеизложенного, целью настоящей работы было выявление иммунотропных свойств синтетического 17 – аминокислотного олигопептида, соответствующего консервативному региону гидрофобного трансмембранного протеина р15Е эндогенного ретровируса человека 1 класса HERV – E  λ 4 – 1 (CKS – 17 λ 4 – 1) при прижизненном введении его экспериментальным животным.

Материалы и методы исследования.

Биологические эксперименты проводили  на мышах - самцах (CBA x C57Bl/6)F_1, в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08. 1977г. № 755).

Исследование морфометрических параметров лимфоидных органов,  выраженности клеточного и гуморального иммунного ответа к эритроцитам барана (ЭБ), митогенной активности при воздействии CKS – 17 λ 4 – 1 было выполнено на 195 мышах-самцах (CBA´C57BL/6)F1, в возрасте  трех месяцев, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск).  Животных содержали в  соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для научных целей (Страсбург, 1986), в условиях лабораторного вивария, в клетках по 10 особей в каждой, на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном (естественном) световом режиме. Олигопептид CKS – 17 λ 4 – 1 вводили внутривенно в дозе 300 мкг/мышь в объеме 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия трехкратно, с интервалом 48 часов. Контрольным группам животных в аналогичном режиме и дозе  вводили растворитель в соответствующем объеме, или 17 - аминокислотный контрольный олигопептид, представляющий собой белок с обратной CKS – 17 λ 4 – 1  последовательностью аминокислот. Через сутки после третьего введения олигопептидов или растворителя определяли абсолютную и относительную массу тимуса и селезенки, а также абсолютную и относительную клеточность данных органов, функциональную активность их иммунокомпетентных клеток. С этой целью перед началом и по окончании эксперимента у животных определяли массу тела, в стерильных условиях извлекали тимус и селезенку, рассчитывали их абсолютную и относительную массу, общее количество ядросодержащих клеток, а также клеточность в пересчете на 1 мг массы органа. Для каждого животного относительные показатели представляли в виде индекса массы тимуса и селезенки  - частного от деления массы органа на массу тела животного, индекса клеточности – частного от деления количества ядросодержащих клеток в органе на массу органа.   Для оценки выраженности клеточного иммунного ответа, на основании параметров реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к ЭБ, третью инъекцию белков или  0,9% NaCl проводили одновременно с введением сенсибилизирующей дозы антигена (0,25% ЭБ в 0,5 мл среды RPMI – 1640). Через 96 часов после введения сенсибилизирующей дозы антигена животным контрольных и опытной групп вводили разрешающую дозу антигена (50% ЭБ в 0,05 мл среды RPMI – 1640) под подошвенный апоневроз правой задней лапы. В контралатеральную лапу в соответствующем режиме и объеме вводили растворитель – среду RPMI – 1640. Учет параметров реакции ГЗТ проводили через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена, по показателям величины отека (мм) правой и левой (позитивно-контрольной) лапы того же животного [4, 14]. Индекс выраженности  реакции  ГЗТ (ИР) определяли индивидуально для каждого животного и рассчитывали по формуле ИР = (Р(мм) опыт – Р(мм) контроль) / Р(мм) контроль, и выражали в процентах.     Для оценки параметров  гуморального иммунного ответа на Т- зависимый антиген (ЭБ) олигопептиды или растворитель вводили, как указано выше, затем животных иммунизировали внутривенно в дозе 2x10⁸ ЭБ и подсчитывали количество антителообразующих клеток (IgM и IgG-АОК) в соответствующие сроки,  по стандартной методике [15].

Пролиферативную активность клеток лимфоидных органов определяли стандартным методом, по включению Н³ тимидина в 72 – часовую культуру клеток тимуса и селезенки. Через сутки после последней инъекции олигопептидов или растворителя мышей  забивали  методом цервикальной дислокации, обрабатывали 70% этиловым спиртом и через разрез в верхней трети грудной клетки извлекали тимус. Затем вскрывали брюшную  полость и  выделяли селезёнку. Органы помещали  во флаконы со средой 199, расстригали ножницами, многократно пропускали    через шприц с иглой, фильтровали через металлическую сетку, 2-3 раза отмывали и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды. Осадок клеток ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят, 10 мМ Hepes - буфера, 4x10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 2 Мм  L-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина, подсчитывали их общее количество. Суспензию клеток селезенки доводили до концентрации 2x10⁶  клеток/мл  полной средой RPMI-1640 и помещали в 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования по 100x10³ клеток на лунку. Суспензию клеток тимуса доводили до концентрации 10 x10⁶  клеток/мл  полной средой RPMI-1640 и помещали в 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования по 500x10³ клеток на лунку.  Использовали  субоптимальную дозу Con A, определённую в серии  предварительных экспериментов, которая составила 2 мкг\мл. Культивирование клеток проводили в СО₂ – инкубаторе при  +37^оС в атмосфере, содержащей  5% СО₂,  в течение 72 часов. За 18 часов  до окончания периода культивирования во все лунки добавляли по 1 мкКu ³Н-тимидина. По окончании культивирования клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab.) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтиллятора, наполненные раствором, содержащим  4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола, и подсчитывали радиоактивность в   жидкостном сцинтилляционном счётчике «Дельта» (США). Результаты оценивали в имп/мин  на 100x10³ клеток.

Статистическая обработка данных проводили с использованием непараметрического Н-критерия Крускала – Уоллиса для множественных независимых групп, с использованием коммерческого пакета программ "Statistica 7.0" (StatSoft, USA). Результаты представляли в виде медианы и интервала между 1 и 4 квартилями (Ме (25%; 75%)). Различия считали статистически значимыми при р< 0,05.

Результаты и обсуждение. Параметры массы и клеточности тимуса и селезенки мышей под действием синтетического ретровирусного олигопептида CKS – 17 λ 4 – 1 представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Параметры массы и клеточности селезенки и тимуса при внутривенном введении олигопептида CKS  – 17  λ 4 – 1 (Mе (25%, 75%))

Груп-пы	Масса мышей, г	Масса и клеточность селезенки				Масса и клеточность тимуса
		Масса,  мг	Индекс массы, мг/г	Клеточ- ность, х 10 6	Индекс клеточ- ности, кл х10 6 /г	Масса, мг	Индекс массы, мг/г	Клеточ- ность, х 10 6	Индекс клеточ ности, кл х10 6 /г
1.	21,1 (20,1; 22,3)	88,0 (84,0; 92,0)	4,09 (4,0; 4,39)	210 (200,0; 218,0)	2,38 (2,25; 2,51)	44,0 (42,0; 49,0)	2,16 (1,94; 2,32)	35,05 (31,9; 37,8)	0,76 (0,71; 0,9)
2.	20,6 (19,8; 22,3)	95,0 (89,0; 98,0)	4,46 (4,24; 4,78)	212 (206,0; 220,0)	2,27 (2,17; 2,4)	48,0 (44,0; 51,0)	2,23 (2,06; 2,33)	39,35 (37,3; 42,0)	0,82 (0,76; 0,89)
3.	20,5 (19,9; 22,2)	120,5 (117,0; 126,0)**	5,81 (5,32; 6,19)**	256,0 (248,0; 260,0)**	2,1 (2,03; 2,15)**	60,0 (58,0; 63,0)**	2,92 (2,69; 3,1)**	52,65 (49,1; 55,7)**	0,86 (0,79; 0,93)

Примечание: n = 30 в каждой группе. 1 – группа животных, получавших изотонический раствор NaCl; 2 – группа животных, получавших раствор контрольного олигопептида; 3 – группа животных, получавших раствор опытного олигопептида. * p<0,05; ** p<0,01 между группами животных.

Было установлено, что контрольные и опытная группы мышей перед началом и по окончании эксперимента не отличались по массе тела. Абсолютная и относительная масса селезенки, а также ее клеточность в группе животных, которым вводили контрольный олигопептид, не превышала соответствующие показатели группы животных, которым вводили изотонический раствор NaCl. Абсолютная масса селезенки мышей, получавших CKS – 17 λ 4 – 1, превышала таковые как при введении контрольного пептида, так и изотонического раствора NaCl. Индекс массы селезенки в этой группе также превышал данный показатель в контрольных группах. Абсолютная и относительная клеточность селезенки животных опытной группы статистически значимо превышала контрольные значения. Следовательно, при введении CKS – 17 λ 4 – 1 происходит увеличение массы селезенки независимо от массы тела животного, за счет увеличения количества ядросодержащих клеток селезенки.

При изучении массы и количества клеток тимуса при воздействии CKS – 17 λ 4 – 1 было выявлено увеличение как абсолютной и относительной массы органа, так и количества тимоцитов. При этом, количество ядросодержащих клеток на единицу массы тимуса не отличалось в опытной и контрольных группах.

Результаты изучения влияния ретровирусного олигопептида на функциональную активность иммунокомпетентных клеток на основании исследования спонтанной и митоген – стимулированной пролиферации представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Пролиферативная активность клеток селезенки и тимуса при внутривенном введении олигопептида CKS  – 17  λ 4 – 1 (имп/мин)  (Mе (25%, 75%))

Группы	0,9% NaCl	Контрольный олигопептид	CKS  – 17 λ 4 – 1
1	6356,3 (3311;7256)	6171,5 (2978; 6517)	9897 (7921;13446)•
2	45186 (36877; 53494)*	45614(34769; 56432)*	44652 (27659; 49872)*
3	1112 (682; 2075)	1345 (675; 2436)	3249 (2879; 5467)•
4	6053 (3429; 9764)	5290 (2875; 8639)*	7848 (4381; 9846)*

Примечание: n = 10 в каждой группе. 1 – клетки селезенки; 2 - ConA – индуцированные клетки селезенки; 3 – клетки тимуса; 4 – ConA – индуцированные клетки тимуса. * p<0,05; ** p<0,01 между группами животных в столбце;• p<0,05; •• p<0,01 между группами животных в строке.

Было установлено, что спленоциты и тимоциты всех исследуемых групп экспериментальных животных отвечают на митогенное воздействие выраженной бласттрансформацией. При исследовании влияния ретровирусного олигопептида, по сравнению с контрольным, на спонтанную и митоген - стимулированную пролиферацию спленоцитов и тимоцитов, было выявлено, что контрольный олигопептид не изменяет указанных показателей; ретровирусный олигопептид стимулирует спонтанную пролиферацию спленоцитов и тимоцитов, не изменяя параметров митоген – индуцированной пролиферации. Следовательно, синтетический олигопептид гомологичный региону env эндогенного ретровируса человека HERV -  E λ 4 – 1 обладает митогенными свойствами в отношении иммунокомпетентных клеток тимуса и селезенки экспериментальных животных.

Показатели гуморального иммунного ответа под действием ретровирусного олигопептида не отличались от соответствующих значений при воздействии контрольного белка.

Данные, полученные при изучении влияния CKS – 17 λ 4 – 1 на   выраженность клеточного иммунного ответа, представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Показатели выраженности клеточного иммунного ответа при воздействии олигопептида CKS  – 17  λ 4 – 1 (%)  (Mе (25%, 75%))

Группы животных	0,9% NaCl	Контрольный олигопептид	CKS  – 17 λ 4 – 1
Параметры ГЗТ	4,05 (3,26; 5,58)	4,43 (3,19; 4,69)	27,12 (18,43; 35,34)*

Примечание. n=25 в каждой группе; *- p<0,05,  ** - p<0,01 между группами животных.

Было установлено, что при воздействии контрольного олигопептида выраженность клеточного иммунного ответа на эритроциты барана не отличается от значений, полученных при введении изотонического раствора хлорида натрия, тогда как ретровирусный олигопептид стимулирует клеточный иммунный ответ, о чем свидетельствуют более высокие параметры выраженности реакции ГЗТ.

Таким образом, при изучении иммунотропных свойств синтетического 17 – аминокислотного олигопептида, соответствующего консервативному региону гидрофобного трансмембранного протеина р15Е эндогенного ретровируса человека 1 класса HERV – E  λ 4 – 1 было установлено, что данный олигопептид, в условиях прижизненного введения его экспериментальным животным, вызывает увеличение морфометрических параметров лимфоидных органов – тимуса и селезенки, за счет увеличения количества их ядросодержащих клеток, стимулирует пролиферативный потенциал тимоцитов и спленоцитов, приводит к увеличению показателей выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа к ЭБ, не оказывая влияния на параметры гуморального иммунного ответа к ЭБ.

Известно, что формирование реакции ГЗТ характеризуется селективной активацией макрофагов и CD4+  лимфоцитов, принадлежащих в основном, к Т-хелперам I типа, а ключевыми элементами данного типа иммунного ответа являются продуцируемые этими клетками ИЛ - 1β, ИФН -g и ФНО -a [17]. При рассеянном склерозе, характеризующимся деструкцией миелина,  данные цитокины, наряду с метаболитами арахидоновой кислоты и NO, являются ключевыми детерминантами патологического процесса [13, 20]. Ранее мы установили, что ЭР λ 4 – 1 ассоциирован с РС [34], а также то, что олигопептид CKS – 17 λ 4 – 1 стимулирует экспрессию генов ряда цитокинов, в том числе ФНО -a в мононуклеарных клетках крови здоровых индивидуумов и больных РС [3]. Следовательно, можно предположить, что стимуляция продукции этих цитокинов при воздействии протеина ЭР HERV – E  λ 4 – 1 является одним из аспектов патогенеза этого заболевания.

Таким образом, синтетический олигопептид CKS – 17 λ 4 – 1, соответствующий высококонсервативному региону трансмембранного ретровирусного протеина эндогенного ретровируса человека класса HERV – E λ 4 – 1 обладает иммунотропными свойствами в частности, в отношении Т – клеточного звена иммунитета, при прижизненном  введении его экспериментальным животным.