Анализ ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов в геноме радужной форели с отдельными фенотипическими признаками
Анализ ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов в геноме радужной форели с отдельными фенотипическими признаками
Аннотация
Методы молекулярной генетики позволяют оценить как полный геном рыбы, так и выявить мутации в функционально важных генах. К числу таких генов можно отнести ген морфогенетического белка (BMP-2), являющегося транскрипционным фактором, регулирующим функциональную активность многих других генов. В частности, он связан с развитием мускулатуры и костной ткани, а также с формированием нервной системы и поведенческих признаков. Учитывая важность гена BMP-2 в росте и развитии рыб, актуальной задачей является выявление однонуклеотидных замен в гене. В работе проведен in-silico поиск оптимальных праймеров к интронам гена для проведения полимеразной цепной реакции, чтобы наработать фрагменты ДНК для последующего секвенирования. По результатам секвенирования двух интронных участков гена BMP-2 удалось выявить полиморфизмы, некоторые из которых оказались связанными с признаком объем эякулята у самцов. Эти данные позволят учитывать генотип при подборе производителей с целью получения потомства с желательными аллелями и, следовательно, фенотипами.
1. Введение
Интенсивное ведение рыбного хозяйства подразумевает, прежде всего, использование аквакультуры в установках замкнутого водоснабжения (УЗВ). К такому использованию пригодны не все виды рыб, однако форель является удобным объектом для выращивания в УЗВ. Селекционная работа с форелью направлена на выведение новых высокопродуктивных форм и пород рыбы, которые были бы наиболее приспособлены к условиям интенсивного выращивания, сохраняя при этом определенную пластичность и адаптационные способности. Относительно новое селекционное достижение – ропшинская золотая форель обладает привлекательной окраской чешуи и сохраняет все лучшие продуктивные качества рыбы с обычной окраской. Аквакультура приобретает сейчас все большее значение в рыбоводстве, так как позволяет получить значительную прибавку продукции на единицу площади в сравнении с ресурсами, извлекаемыми из природных водных бассейнов. Среди видов рыб, приспособленных к условиям интенсивного выращивания в аквакультуре, выделяется радужная форель. Она является источником ценного диетического питания, быстро растет и генетически пластична, что дало возможность селекционерам вывести много пород, удовлетворяющих самым разным потребностям , .
Развитие генетических технологий предоставило научное обоснование многих селекционных программ и ускорило появление новых высокопродуктивных форм радужной форели. В СГЦ рыбоводства (пос. Ропша, Ленинградская обл.) сравнительно недавно было достигнуто новое селекционное достижение – ропшинская золотая форель, отличающаяся привлекательным внешним видом и сохранившая при этом все лучшие характеристики форели с традиционной окраской чешуи , , . Зная генетические особенности новых форм рыбы, можно эффективнее планировать работу для дальнейшего совершенствования рыбы. Актуальными вопросами в рыбоводстве являются характеристика поголовья на предмет генетических различий между популяциями, вариабельности внутри групп и т.д. Важным направлением работ является интрогрессия ценных генов в новые популяции, что улучшает их хозяйственно-ценные признаки. Скрещивание генетически различных пород и популяций ставит своей целью получение эффекта гетерозиса . Одним из успешных применений селекции, направленной на повышение внутрипопуляционного разнообразия (гетерозиготности) является создание породы радужной форели рофор. В силу заложенного в особях разнообразия рыба хорошо приспосабливается к меняющимся условиям содержания (новые корма, изменение температуры и т.д.). Молекулярная генетика все активнее используется в решении как фундаментальных вопросов генетики рыб, так и в решении практических задач.
Важным направлением генетических исследований является выявление однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), локализующихся в важных для роста и развития рыбы генах , . К числу таких генов можно отнести морфогенетический ген, такой как BMP-2, являющийся транскрипционным фактором для целого ряда других генов , , . В частности, мутации в гене связаны с развитием костной и мышечной тканей у рыбы, формированием нервной системы и развития поведенческих признаков , . Экзоны гена уже изучались ранее, были установлены ассоциации между полиморфизмами и продуктивными признаками. Известно, что интроны у животных могут иметь регуляторную функцию, модулируя экспрессию генов, поэтому интерес представляет выявление в них мутаций и связи последних с формированием фенотипических признаков. Ген BMP-2 является довольно консервативным, т.е. встречается у многих позвоночных, при этом у каждого вида существует несколько вариантов этого гена . Мутации в экзонах генов часто приводят к изменению аминокислотной последовательности в кодируемых этими генами белках, что сказывается на формировании фенотипа. Интроны генов не принимают непосредственного участия в детерминировании первичной структуры белка, однако, могут играть роль в регуляции экспрессии генов. Все эти научные факты предопределили стремление более глубоко изучить наличие SNP в интронах гена и выявить их связь с фенотипическими признаками у ропшинской золотой форели , .
Цель исследования – выявить однонуклеотидные полиморфизмы в интронных участках гена BMP-2 и связать их наличие с продуктивными признаками, учтенными при бонитировке самцов радужной форели – ропшинская золотая форель.
2. Методы и принципы исследования
Объектом исследования были самцы радужной форели относительно новой селекционной формы – ропшинская золотая форель возрастом 2 года, в количестве 16 особей.
Длину тела и другие метрические параметры измеряли во время плановых бонитировок с помощью мерной доски. Для упрощения процедуры рыбу временно иммобилизовали гвоздичным маслом. Учитывали следующие размерно-весовые характеристики (масса тела, длина тела по Смиту, длина чешуйчатого покрова, длина головы, высота и толщина тела), а также репродуктивные показатели у самок – вес икры, масса одной икринки, количество икры в 5 граммах и самцов – объем эякулята и подвижность сперматозоидов. Этот этап работы проводился в рамках плановых бонитировок на базе СГЦ рыбоводства (пос. Ропша, Ленинградской обл.). Во время бонитировки брали биологический материал в виде кусочка ткани, который замораживали для последующей доставки в лабораторию молекулярной генетики ВНИИГРЖ (Санкт-Петербург, Пушкин). Выделение геномной ДНК проводили обычным фенольным способом после лизиса клеток додецилсульфатом натрия и депротеинизации ферментом протеиназа К. В качестве анализируемого гена был выбран ген BMP-2 на четвертой хромосоме, кодирующий костный морфогенетический белок 2. In-silico поиск в базе данных нуклеотидных последовательностей NCBI позволил выбрать два интрона, к нуклеотидным последовательностям которых провели дизайн праймеров с помощью онлайн программы Primer 3 Plus для амплификации этих участков.
Амплификацию фрагментов ДНК проводили в приборе Thermal Cycler T100 (Bio-Rad, США) с использованием следующих режимов: 95°С – 20 сек., 60°С – 20 сек., 72°С - 20 сек. и финальная элонгация 72°С – 4 минуты. Часть амплификата проверяли в 1,5% агарозном геле. Затем продукт ПЦР очищали на микроколонках методом гель-фильтрации для удаления всех низкомолекулярных примесей, включая соли. Секвенирование очищенной ДНК проводили в секвенаторе Genetic Analyzer 3500 фирмы Applied Biosystems™ с применением рекомендованных производителем наборов BigDye® Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit. После получения данных о нуклеотидных последовательностях в изучаемых интронах всех 32 особей проводили выравнивание, используя программный пакет MEGA 6.06 (https://www. megasoftware.net) с целью выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Биометрическая обработка данных выполнялась с помощью программы Statistica 10.
3. Основные результаты
Секвенирование двух интронных участков гена BMP-2, локализованного на хромосоме 4, выявило ряд нуклеотидных замен у самцов радужной форели (табл. 1).
Таблица 1 - Замены нуклеотидов в интронах гена BMP-2 на 4-й хромосоме у самцов и частоты генотипов
SNP | BMP-2_1-IN | BMP-2_1-IN | BMP-2_2-IN | |||
Позиция | A70824829G | G70824841T | G70826709A | |||
Генотип, n | Частота | Генотип, n | Частота | Генотип, n | Частота | |
Ропшинская золотая | AA=9 | 0,563 | GG=0 | 0,000 | AA=1 | 0,063 |
AG=6 | 0,375 | GT=13 | 0,813 | AG=6 | 0,375 | |
GG=1 | 0,063 | TT=3 | 0,188 | GG=9 | 0,563 | |
Анализ ассоциаций генотипов с размерно-весовыми и продуктивными признаками позволил доказать влияние замен нуклеотидов на фенотип. Интересно, что мутация в интронном участке изучаемого гена в позиции G70824841Т у самцов привела к статистически значимым различиям у носителей генотипов GT и TT по объему эякулята (табл. 2). Несмотря на небольшое число носителей генотипа ТТ (3 особи) анализ показал статистически значимые различия между генотипами TT и GT. Самцы генотипа GT превосходили самцов генотипа TT (5,07 против 3,43 мл). По другим признакам различий между генотипами выявлено не было, что может быть связано с небольшой выборкой.
Таблица 2 - Ассоциации генотипов в гене BMP-2_1IN (позиция G70824841Т) на 4-й хромосоме с фенотипическими признаками у самцов золотой форели
G70824841Т | Генотип GT (n=13) | Генотип ТТ (n=3) |
Позиция | ||
Масса рыбы, г | 663,85±40,81 | 695,00±79,11 |
Длина тела по Смиту, см | 34,57±0,73 | 36,57±1,67 |
V эякулята, мл | 5,07±0,38а | 3,43±0,28в |
Подвижность, сек/% | 25,85±0,55 | 25,67±1,33 |
Примечание: GT/ТТ (a-в, Р < 0,01)
4. Заключение
Таким образом, выявленные в ходе секвенирования однонуклеотидные полиморфизмы в одном из интронных участков гена BMP-2 (позиция G70824841T) оказались ассоциированы с таким важным селекционным признаком у самцов радужной форели, как объем эякулята. По другим бонитировочным показателям статистически значимой разницы между генотипами не установлено, что может быть связано с небольшой выборкой. Увеличение количества особей, возможно, приведет к выявлению и других ассоциаций. Следовательно, выявление однонуклеотидных полиморфизмов с последующим анализом ассоциаций с фенотипическими признаками является плодотворным при планировании селекционной работы с рыбой для подбора пар производителей с целью получения потомства, несущего желательные генотипы.