Моделирование питательной среды для максимального накопления биомассы дрожжей рода Rhodotorula
Моделирование питательной среды для максимального накопления биомассы дрожжей рода Rhodotorula
Аннотация
Кормопроизводство в России активно развивается и переходит на импортозамещающую политику. Поэтому многие предприятия нуждаются в качественном сырье для производства комбикормов и премиксов для рыбных хозяйств. Одним из ключевых компонентов кормов являются каротиноиды, которые улучшают здоровье рыб и органолептические показатели продуктов рыбного промысла. Дрожжи – эффективные продуценты каротиноидов, которые содержат в себе много белка и способны накапливать в процессе метаболизма биологически активные вещества. На каротиногенез дрожжевой клетки большое влияние оказывает химический состав питательной среды и условия культивирования. Моделированием питательной среды и созданием определенных условий при культивировании можно добиться максимального накопления биомассы и целевого продукта дрожжами.
1. Введение
Кормопроизводство в Российской Федерации последние пять лет активно развивается и переходит от импорта кормов для рыб к отечественному производству , . Комбикорма и премиксы, используемые в рыбных хозяйствах, должны иметь определенный состав, чтобы популяция животных росла и развивалась без болезней и патологий. Состав кормов оказывает существенное влияние на здоровье рыб – при потреблении недостаточного количества микро и макроэлементов, витаминов и минералов, страдает репродуктивная система животных, ухудшаются качества получаемого мяса и икры . Основой кормов для рыб служат легкоусвояемые белки, которые необходимы для развития мышечной ткани, также корма должны содержать липиды и витамины, необходимые для здорового метаболизма.
В качестве белковой составляющей многие производители используют рыбную муку, полученную путем переработки отходов рыбного производства. Протеин из данного сырья не всегда отвечает требованиям по безопасности кормов и премиксов, так как для производства рыбной муки используются промысловые мелкие морские рыбы, в организме которых часто встречаются различные токсины . В связи с этим у производителей кормов возникает потребность в источнике белков, который будет соответствовать предъявляемым требованиям. Дрожжи являются перспективным источником белка за счет их быстрой скорости роста и накопления биомассы. Клетка дрожжей содержит до 50% (в сухом веществе) протеинов, состоящих из незаменимых аминокислот, которые лучше и успешнее усваиваются рыбами, чем рыбная мука или растительный белок . Дрожжевые базидиомицеты растут на простых питательных средах и не требуют особых условий культивирования. Некоторые представители микроскопических грибов также способны продуцировать биологически активные вещества – каротиноиды, витамины.
Каротиноиды – пигменты от оранжевого до красного цвета, синтезируемые многими высшими растениями, водорослями и микроскопическими грибами. Соединения, которые относятся к группе каротиноидов (β-каротин, ликопин, астаксантин, зеаксантин и др.) можно добавлять в корма, и они положительно влияют на насыщенность окраски мышечной ткани рыб и цвет икры . Антиоксидантные свойства каротиноидов благоприятно влияют на здоровье рыб, предотвращая развитие рака и других заболеваний. Они также увеличивают стрессоустойчивость рыб и их сопротивление негативным факторам окружающей среды. При добавлении каротиноидов в состав комбикормов было также замечено их влияние на сроки хранения продукции. Каротиноиды препятствуют окислению липидов в процессе хранения и прогорканию сухих веществ, что также выгодно для рыбных хозяйств, которые закупают большие объемы и долго их хранят .
Среди всех продуцентов каротиноидов больше преимуществ имеют красные дрожжи. Род дрожжей Rhodotorula показывает высокую эффективность, и они способны синтезировать большое количество каротиноидов в процессе метаболизма. Микроводоросли уступают дрожжам, так как при их выращивании требуется строгое соблюдения условий культивирования, чтобы не было заражения простейшими, и более сложный состав питательной среды. Клетки микроводорослей также очень плотные, что препятствует извлечению каротиноидов и делает процесс очистки более трудоемким и требующим дополнительных затрат . Биомасса дрожжей эффективно выращивается на отходах пищевой промышленности и устойчива к изменениям окружающей среды, что делает ее технологичным продуцентом. Изменяя условия культивирования дрожжей, можно добиться продуцирования каротиноидов определенного химического состава. С помощью облучения биомассы разными длинами волн света наблюдается изменение количественного выхода каротиноидов .
Питательная среда для выращивания дрожжей оказывает существенное влияние на количество продуцируемых каротиноидов и их качественный состав. В зависимости от физико-химического состава субстрата, накопление каротиноидов в одном штамме различно. Моделирование питательной среды с помощью обогатителей или составление собственной рецептуры позволяет контролировать синтез каротиноидов и добиться максимального выхода целевого продукта .
Цель данного исследования – исследование влияния состава питательной среды на накопление биомассы дрожжами рода Rhodotorula.
2. Условия, материалы и методы проведения исследований
Для проведения исследований нами были выбраны штаммы Rhodotorula rubra и Rhodotorula roseum. Пробирки с музейными культурами дрожжей Rhodotorula получены из Всероссийской коллекции культур сельскохозяйственного назначения ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии».
На начальном этапе исследования оба вида дрожжей выращивали на универсальной плотной питательной среде ГМФ-агар в чашках Петри при 28–30 °C. Выращенные колонии дрожжей были насыщенного оранжевого цвета, что свидетельствовало о наличии большого количества пигментов.
На следующем этапе исследования необходимо было накопить биомассу, поэтому дальнейшее культивирование дрожжей проводили на жидких питательных средах в лабораторных ферментерах в лаборатории микробиологии высшей школы биотехнологии и пищевых производств СПбПУ.
Анализ литературных источников показал, что для выращивания дрожжей больше всего подходят питательные среды, содержащие легкоусвояемые источники углеводных и азотистых питательных веществ и минеральные соли, поэтому в качестве основы для модельных сред были взяты углеводы. Картофельный отвар в одном варианте среды был выбран в качестве дешевого и легкодоступного источника полисахарида крахмала. Контролем служила универсальная питательная среда ГМФ, на которой хорошо растут все микроорганизмы.
После анализа литературных источников были выбраны три варианта питательных сред для культивирования каротиноидных дрожжей:
Вариант 1 – универсальная питательная среда ГМФ (см. табл. 1).
Таблица 1 - Состав питательной среды (вариант 1)
Компонент среды | Концентрация компонента (г/л) |
ГМФ–основа | 15,0 |
Натрия хлорид | 9,0 |
Вариант 2 – питательная среда на основе картофельного отвара (см. табл. 2).
Таблица 2 - Состав питательной среды (вариант 2)
Компонент среды | Концентрация компонента |
Картофельный отвар | 1 л |
Глюкоза | 20 г/л |
Для приготовления питательной среды брали 300 г картофеля и варили в 1 литре воды до готовности, после чего брали готовый картофельный концентрат и доводили дистиллированной водой до 1 л. Затем в картофельный отвар добавляли 20 г/л глюкозы микробиологического и стерилизовали среду в течение 20 мин при температуре 125 °C.
Вариант 3 – полусинтетическая питательная среда на основе маннита, дрожжевого экстракта и солей (см. табл. 3).
Таблица 3 - Состав питательной среды (вариант 3)
Компонент среды | Концентрация компонента (г/л) |
Маннит | 10,0 |
Дрожжевой экстракт | 1,0 |
K2HPO4 | 0,5 |
MgSO4*7H2O | 0,2 |
NaCl | 0,1 |
При проведении исследований выращивание дрожжей проводили в лабораторных условиях в ферментерах объемом 0,5 л. В каждый вариант с питательной средой вносилась чистая культура дрожжей Rhodotorula rubra и Rhodotorula roseum в стерильных условиях.
По окончании процесса культивирования на жидких питательных средах определяли титр выращенных микроорганизмов и суммарное количество каротиноидов.
Суммарное содержание каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом в кювете, имеющей толщину слоя 1 см, длина волны 450 нм. В качестве раствора сравнения использовали этиловый спирт.
Расчет количественного суммарного содержания каротиноидов в мкг/г (Х) (в пересчете на β-каротин), проводили по формуле:
,
где:
D – оптическая плотность раствора испытуемого образца;
а – навеска в граммах;
100 – разведение в миллилитрах;
2500 – Е экстинкция (показатель поглощения удельный β-каротина в спирте при длине волны 450 нм);
10 – содержание β-каротина в 1 мл 1 % раствора в спирте в миллиграммах.
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Результаты посевов культуры Rhodotorula rubra
Титр дрожжей Rhodotorula rubra на трех вариантах сред представлен на рисунке 1.
Рисунок 1 - Титр культуры Rhodotorula rubra к моменту окончания процесса культивирования 1, 2, 3
3.2. Результаты посевов культуры Rhodotorula roseum
Титр дрожжей Rhodotorula roseum на трех вариантах сред представлен на рисунке 2.
Рисунок 2 - Титр культуры Rhodotorula roseum к моменту окончания процесса культивирования 1, 2, 3
Общее количество каротиноидов (в пересчете на β-каротин), продуцируемых дрожжами Rhodotorula rubra получилось 1792,73 ±0,05 мкг/г, а этот же показатель у дрожжей Rhodotorula roseum получился 1340,00 ±0,05 мкг/г.
4. Заключение
По результатам проведенных исследований показано, что наилучшей питательной средой для выращивания дрожжей Rhodotorula rubra и Rhodotorula roseum является полусинтетическая питательная среда на основе маннита, дрожжевого экстракта и минеральных солей (вариант 3). Наибольшее суммарное содержание каротиноидов было получено из штамма Rhodotorula rubra. Таким образом, данный штамм наиболее технологичен и более коммерчески эффективен.