АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА BACILLUS THURINGIENSIS SSP. GALLERIAE АК-4, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ОСАДОЧНЫХ ПОРОД ОЗЕРА БАЙКАЛ

¹Мокрушина О.С., ²Андреева И.С., ³Мазуркова Н.А., ⁴Бурцева Л.И., ⁵Закабунин А.И.

¹аспирант,  ^2,3,4кандидат биологических наук, ФБУН государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово Новосибирской обл., Россия; ⁴Институт Систематики и Экологии Животных СО РАН, г.Новосибирск, Россия; ⁵Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия

АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА BACILLUS THURINGIENSIS SSP. GALLERIAE АК-4, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ОСАДОЧНЫХ ПОРОД ОЗЕРА БАЙКАЛ 

Исследованы морфологические, культуральные и антагонистические свойства бактериального изолята, формирующего параспоральные кристаллы, выделенного из осадочных пород Байкала. В соответствии с выявленными фенотипическими признаками штамм определен как Bacillus thuringiensis ssp. galleriae. Показана его инсектицидная активность к представителям отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, антибиотическая активность к таким патогенным микроорганизмам как Staphylococcus aureus, Salmonella thiphimurium, Shigella sonnei, Candida albicans и ряду других, а также высокая активность относительно вирусов гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), что позволяет считать штамм Bacillus thuringiensis ssp. galleriae АК-4 перспективными для дальнейшей разработки инсектицидных, антимикробных и противовирусных препаратов.

Ключевые слова: штамм Bacillus thuringiensis, идентификация,  инсектицидная, антимикробная, противовирусная  активность.

¹Morkushina O.S., ²Andreeva I.S., ³Mazurkova N.A., ⁴Burtseva L.I., ⁵Zakabunin A.I.

¹graduate student,  ^2,3,4PhD in biology, FSBI State Research Center of Virology and Biotechnology Vector, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; ⁴Institute of Systematics and Ecology of Animals SB RAS, Novosibirsk, Russia; ⁵Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia

ANTAGONISTIC PROPERTIES OF BACILLUS THURINGIENSIS SSP. GALLERIAE AK-4 STRAIN ISOLATED FROM SEDIMENTARY ROCKS OF LAKE BAIKAL 

Morphological, cultural and antagonistic properties of a bacterial isolate forming parasporal crystals and isolated from sedimentary rocks of Baikal have been studied. In accordance with the revealed phenotypic characteristics, the strain was identified as Bacillus thuringiensis ssp. galleriae. Its insecticidal activity against the representatives of the orders Lepidoptera, Coleoptera and Diptera, antibiotic activity against pathogenic microorganisms such as Staphylococcus aureus,  Salmonella thiphimurium, Shigella sonnei, Candida albicans  and some others as well as high activity against human influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2) and avian influenza virus A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) has been shown, which allows us to consider Bacillus thuringiensis ssp. galleriae AK-4 strain to be promising for further development of insecticidal, antimicrobial and antiviral preparations.

Keywords: Bacillus thuringiensis strain, identification, insecticidal, antimicrobial, antiviral activity.

Биологически активные вещества, продуцируемые микроорганизмами, широко используются для разработки лекарственных средств антимикробного действия, включая противовирусные препараты. Среди микроорганизмов различных таксономических групп, обладающих антибиотической активностью, микроорганизмы рода Bacillus давно известны как активные продуценты антибиотиков [1]. Важнейшими свойствами бацилл являются их антагонистическая активность ко многим патогенным и условно патогенным микроорганизмам, выражающаяся в подавлении развития кандид, стафилококков, кампилобактерий, иерсиний. Показана также противовирусная активность метаболитов штаммов рода Bacillus на ряд вирусов теплокровных, в частности , на энтеровирусы ( ЕСНО-3, ЕСНО-6, Коксаки В и др.) [2]. Штаммы спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), обладающие способностью формировать при споруляции параспоральные кристаллические включения белковой природы, многие годы используются как основа биоинсектицидных препаратов. Кристаллические белки, или δ-эндотоксины [3] обусловливают, главным образом, инсектицидную активность Bt, хотя многие штаммы этого вида продуцируют и другие факторы антибиотической активности: термостабильный β-экзотоксин, лецитиназу (фосфолипаза С), протеазы, хитиназы и так называемые VIP-токсины, белки, секретируемые во время фазы вегетативного роста клеток Bt [4]. Известно также, что различные подвиды Bt обладают избирательным антагонистическим действием в отношении микроорганизмов [5-7]. Антибиотическое действие Bacillus thuringiensis (Bt) более всего проявляется относительно бактерий, дрожжей и грибов, известна также противовирусная активность штаммов Bt [8, 9].

В настоящей работе представлены данные по исследованию морфологических, культуральных и антагонистических особенностей спорообразующего изолята, формирующего параспоральные кристаллы, идентифицированного как Bt ssp. galleriae, для выяснения его биотехнологического потенциала.

Материалы и методы

Выделение и идентификация штамма. Использованный в работе штамм Bt ssp. galleriae АК-4 изолирован на полной среде, при рН 7,0-7,2 и температуре инкубирования 26-28°С из образца керна глубокого бурения дна озера Байкал, отобранного во время работ по международному проекту «Байкал-бурение» (1999 г.) из скважины, где глубина взятия проб составляла 146,74 м., возраст осадочных пород – 3,4-3,5 млн. лет. Изучение морфологических, физиологических и биохимических свойств штамма и антибиотическую активность выполняли стандартными методами [10, 11]. Особенности морфологии клеток, форму и размеры параспоральных включений оценивали с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Germany) используя фазово-контрастную микроскопию. Штамм Bacillus thuringiensis ssp. galleriae АК-4 депонирован в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”» под колл. № В-1275.

Определение инсектицидной активности проводили на лабораторных линиях насекомых поддерживаемых в ИСиЭЖ СО РАН, представителей 3-х отрядов: Hyponomeuta evonymellus (Lepidoptera), Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera) и Aedes aegypti (Diptera) методом «быстрого скрининга», согласно [4].

Антимикробные свойства водорастворимых метаболитов штаммов Bt определяли методом отсроченного антагонизма с использованием патогенных тест-штаммов Staphylococcus aureus 6646, Salmonella thyphimurium 2606, Shigella sonnei 32 , Candida albicans 620, Bacillus subtilis 6644, Escherichia coli 6645, рекомендованных Государственной Фармакопией РФ для определения антибиотических свойств лекарственных препаратов, и ряда других патогенов  из «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”».

Приготовление препарата для тестирования на противовирусную активность. С использованием культуры исследуемого штамма, наработанного на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл/мл и вносили в количестве 1% в колбы со средой LB. Культивировали высевы в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки (КТ 104, Россия) при температуре 30°С. Для приготовления препарата полученную культуральную жидкость штамма (КЖ) центрифугировали при 6000 об./мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через фильтры Whatman и при необходимости хранили до использования при температуре минус 18-20^°С.

Определение токсичности и противовирусной активности препарата. Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали штаммы вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (А/H5N1) и вируса гриппа человека А/Aichi/2/68 (A/H3N2) из «Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”» и чувствительную к ним перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из «Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”».

Определение токсичности препаратов. Суспензию с известной концентрацией клеток MDCK разводили средой RPMI-1640 до концентрации 1×10⁵ кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов, инкубировали при температуре 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности 2-3 суток до образования монослоя клеток. С использованием среды RPMI-1640 готовили разведения препаратов Bt и вносили по 150 мкл в лунки планшета с клетками MDCK, выдерживали при температуре 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности в течение 2-х суток. Наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов, оценивали с помощью инвертированного микроскопа. При определении противовирусной активности препарата использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения вирусалантоисной жидкости (ВАЖ) с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препарата в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл выбранного варианта препарата и 100 мкл разведения ВАЖ, инкубировали 2 суток при температуре 37ºC в атмосфере 5% СО₂. Через 2 суток в каждой лунке планшета регистрировали цитопатогенное действие в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации с 1% эритроцитами кур.

Результаты и обсуждение

Фенотипические признаки штамма. Клетки бактериального изолята АК-4 представляли собой грамположительные палочки, расположенные по 1-2 и в цепочках, размером 1,0-1,2×3-5 мкм, образующие эндоспоры и параспоральные включения (рис. 1). При определении биохимических признаков показано, что изолят Ак-4, как свойственно бактериям вида Bt, гидролизует желатин и казеин, восстанавливал нитраты, быо положителен в тестах на каталазу, оксидазу, уреазу, в реакциях Фогес-Проскауера и с метиловым красным, гидролизовал глюкозу и мальтозу, но не арабинозу, ксилозу, манит, сахарозу и лактозу, не выделял аммиак и сероводород, не образовывал индол, не утилизировал цитрат. Штамм обладал высокоактивной лецитиназой и липазой, что важно, так как эти экзоферменты Bt, также как протеазы и хитиназы, рассматриваются как факторы токсичности, облегчающие размножение микроорганизма-патогена в организме-хозяине [4]. В соответствии с результатами внутривидовой идентификации штаммов, учитывающей принадлежность к серовару, морфологию кристаллов, ряд биохимических и антибиотических свойств, определена принадлежность изолята АК-4, образующего эндоспоры и параспоральные включения, к подвиду Bt ssp. galleriae (рис. 1, таблица 1).

 

Рис. 1. Морфология колоний, спор и параспоральных кристаллов штамма Bt ssp.galleriae АК-4 (фазово-контрастная микроскопия, ×2500); тонкой стрелкой обозначены кристаллы, толстой – споры.

Таблица 1. Внутривидовая характеристика штамма Bt ssp.galleriae АК-4

Штамм	Н-анти-ген	Bt ssp.	Морфология кристаллов	ЛВР	уреаза	Кислота из			пигмент
						маннозы	салицина	сахарозы
АК-4	5ab	galleriae	Ромбовидные, округлые	-	+	-	+	-	-

Обозначения: +, положительное проявление признака; -, отрицательная реакция; ЛВР – лицетовицелазная реакция.

Антимикробная активность штамма  Bt ssp. galleriae АК-4 была наиболее выражена относительно патогенных штаммов Staphylococcus aureus 209 p,  Salmonella thiphimurium 2606,  Shigella sonnei 32,  Candida albicans 620, Bacillus subtilis ATCC 6633. На остальные, использованные в опыте бактерии, антибиотическая реакция была незначительной или отсутствовала (табл. 3).

Таблица 3. Исследование антимикробного действия штамма Bt ssp.galleriae АК-4

 

Инсектицидная активность. Обработка личинок комаров Aedes aegypti споро-кристаллической смесью штамма АК-4 показала высокую инсектицидную активность, сравнимую по токсичности с контрольным производственным штаммом Bt ssp. kurstaki К-1, использующимся для производства препаратов инсектицидного значения  (табл. 4).

Таблица 4. Энтомопатогенная активность штамма Bt ssp.galleriae АК-4

Примечание: АК-1 – контрольный штамм Bt ssp. kurstaki К-1

Противовирусная активность штамма. Образцы препаратов 3/1 и 3-10/1, приготовленные на основе культуральной жидкости Bt АК-4, хранили при температуре минус 18-20°С в течение 3 месяцев и затем использовали для экспериментов наряду со свежеприготовленными образцами препаратов с разным разведением (образцы 1, 3 и 3-10). При проведении тестов на токсичность и противовирусное действие было выяснено, что используемые в опыте разведения препаратов Bt ssp. galleriae АК-4 были слабо токсичны для клеток MDCK (табл.5) и в разной степени подавляли вирусы гриппа используемые в опыте (табл. 6).

Таблица 5. Токсичность образцов препаратов на основе штамма Bt ssp. galleriae АК-4 относительно клеток MDCK

Образец	Исходная концентрация		Разведения препарата								Контроль клеток
			1:2		1:5		1:10		1:20
1	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-
3	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
3/1	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
3-10	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
3-10/1	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-

Обозначения: +  есть токсичность;  -  нет токсичности препарата.

Таблица 6. Противовирусная активность образцов препаратов на основе штамма Bt ssp. galleriae АК-4 (применена профилактическая схема)

Вариант опыта	Титр вируса в lg ТЦД50 /мл через 48 ч / Разведения препарата, условия подготовки к опыту
	A/Aichi/2/68 (H3N2)				A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
	1:5, без хранения	1:5, хранение 3 месяца	1:10, без хранения	1:10, хранение 3 месяца	1:5, без хранения	1:5, хранение 3 месяца	1:10, без хранения	1:10, хранение 3 мес
АК-4	3,5	4,7	1,7	2,5	4,7	6,5	0	4,2
Контроль вируса	6,7	6,7	6,7	6,7	8,0	8,0	8,0	8,0

Противовирусную активность относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2 и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)  проявили все варианты препаратов штамма Bt АК-4 , включая хранившиеся в течение 3-х месяцев при температуре минус 18-20°С.

В результате проведенных исследований показано, что рассматриваемый штамм Bt ssp. galleriae АК-4 обладает высокой инсектицидной активностью к представителям отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera. Для штамма определена также выраженная антибиотическая активность по отношения к патогенным микроорганизмам Staphylococcus aureus, Salmonella thiphimurium, Shigella sonnei, Candida albicans. Препараты, приготовленные на основе КЖ штамма Bt ssp. galleriae АК-4, эффективно подавляли размножение вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на клетках MDCK, что позволяет считать их перспективными для дальнейшей разработки биопрепаратов не только инсектицидного и антимикробного, но и противовирусного назначения.

Дальнейшие исследования предполагают выделение, очистку и идентификацию секретируемых метаболитов штамма Bt ssp. galleriae АК-4, проявляющих антибиотическую и противовирусную активность. Предварительный анализ отдельных полученных фракций подтвердил наличие высокой противовирусной активности метаболитов исследуемого штамма Bt. Следует отметить, что водорастворимые метаболиты культуральной жидкости штамма и лизаты биомассы обладали выраженной РНК-азной активностью, что может явиться одной из причин подавления используемыми препаратами Bt размножения РНК-содержащих вирусов, к которым относятся вирусы гриппа.

 

Литература

1. Katz E., Demain G. // Bacterial Rev.- 1977.- V 1.- N 2.- P. 449-474.
2. Михайлов Н.А., Ф.Г. Нагиева, О.М. Гринько, В.В. Зверев /Ж. микробиол., 2010, №2, С.69-74.
3. Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J., et al. // Mol. Biol. Rev. – 1998. – V. 62. – N. 3. – P. 807-813.
4. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. Глупова В. В. – М.: Круглый год, 2001. – 716 c.
5. FavretM.E., Yousten A.A. Thuricin: the bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis // J. Invertebr. Pathol. – 1989. – V.53. – P. 206-216.
6. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. Действие дельта-эндотоксинов четырёх подвидов В. thuringiensis на различных прокариот // Микробиология. -1997. - Т. 66. - №1. - 25-31.
7. Каменек Л.К., Климентова Е.Г., Тюльпинева А.А. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki на некоторые аэробные бактерии-фитопатогены // Ученые записки УлГУ, Ульяновск.— 2000.— Вып.1(2).— С.78–82.
8. Романенко Н.Д. Попов И.О., Таболин С.Б. и др. Перспективы использования бактерий-антагонистов против наиболее фитопатогенных видов нематод, вирусов и грибов // АгроXI.-2008.- № 1-3.- С.23-28.
9. Андреева И.С., Мазуркова Н.А., Булычев Л.Е. и др.  Антагонистическая активность атипичных штаммов Bacillus thuringiensis относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1//В сборнике материалов IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Курск, июнь 2011: ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, 2011. C. 12-15.
10. Методы общей бактериологии /Под ред. Ф. Герхарда и др. – М.: Мир, 1983. – Т. 1. – 536 с.; 1984. Т. 3. 264 с.
11. "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology". 8th ed. / Ed. John G. Holt. – Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986. – V.1-2. – 1105 p.