ФЛАВОНОИДЫ ЛИСТЬЕВ ВЕРБЕНЫ ЛИМОННОЙ
ФЛАВОНОИДЫ ЛИСТЬЕВ ВЕРБЕНЫ ЛИМОННОЙ
Аннотация
Вербена лимонная (Aloysia citriodora Palau) – многолетний кустарник, в диком виде произрастает в Южной Америке (Аргентине, Бразилии, Чили, Парагвае). Сырье вербены лимонной богато эфирным маслом, фенольными соединениями (фенилпропаноиды, флавоноиды, дубильные вещества), сапонинами, полисахаридами, витаминами. Целью данной работы явилось качественное и количественное изучение флавоноидных соединений листьев вербены лимонной. Объектом для настоящей работы послужили листья вербены лимонной, собранные на территории Марокко в июле 2019 года. Растительный материал был высушен воздушно-теневым способом. Лекарственное сырье представляло собой цельные или измельченные листья с характерным ароматным запахом. Для идентификации флавоноидных соединений применяли метод хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ). Количественный анализ флавоноидов проводили с использованием дифференциального фотометрического анализа, основанного на способности комплексных соединений флавоноидов с ионами алюминия поглощать электромагнитное излучение в ультрафиолетовой области спектра. В результате исследования установили качественный состав флавоноидов, оптимальные условия извлечения флавоноидов из сырья и их количественное содержание в листьях вербены лимонной в процентах в пересчете на лютеолин, проведена валидационная оценка методики количественного определения флавоноидов в исследуемом сырье.
1. Введение
Листья вербены лимонной издревле широко применяются в народной медицине для лечения различных заболеваний [1], [4], [5], [6]. Вербена лимонная богата фенольными соединениями такими, как фенилпропаноиды, фенолокислоты, флавоноиды, дубильные вещества [7]. В настоящее время проводится интенсивное изучение биологических свойств полифенольных соединений, в частности, флавоноидов. Фармакологическое действие флавоноидов обусловлено их антиоксидантными, антирадикальными свойствами и способностью устранять гипоксию [8]. Целью настоящей работы явилось изучение качественного и количественного содержания флавоноидов листьев вербены лимонной и проведение валидационной оценки предлагаемой методики количественного определения флавоноидов в сырье.
2. Методы и принципы исследования
Объектом исследования служили листья вербены лимонной, заготовленные на территории Марокко в фазу массового цветения в июле 2019 года. Растительный материал был высушен воздушно-теневым способом. Лекарственное сырье представляло собой цельные или измельченные листья с характерным цитрусовым запахом.
Исследование качественного состава флавоноидов проводили методом восходящей хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) в извлечениях, полученных спиртом этиловым 70%. Хроматографические исследования осуществляли на пластинках «Sorbfil» марки ПТСХ-АФ-А-УФ, Россия в системе н-бутанол – кислота уксусная концентрированная – вода (4:1:2). В качестве стандартных образцов использовали 0,05% растворы рутина, лютеолина, кверцетина, кверцетрина, апигенина. Детекцию зон адсорбции флавоноидов осуществляли по их флуоресценции в УФ-свете при длине волны 365 нм до и после обработки хроматограмм парами аммиака и сравнивали их окраску и положение (величину Rf) с соответствующими зонами адсорбции стандартных образцов [2].
Количественное содержание суммы флавоноидов определяли дифференциальным фотометрическим методом по реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида [2], [9], [10], [11]. Данный метод предусматривает использование в качестве контроля испытуемого раствора без реактивов, что позволяет исключить влияние окрашенных и сопутствующих веществ, а также веществ, не образующих комплекс с реактивами.
Методика определения. Точную навеску измельченного сырья массой около 1,0 г помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, приливали 30 мл 70% этилового спирта, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин с момента закипания спирта этилового в колбе. Экстракцию повторяли трижды в описанных выше условиях. После охлаждения полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл (раствор А). 5 мл раствора А вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, 0,1 мл разведенной уксусной кислоты, доводили до метки спиртом этиловым 96% и перемешивали (раствор В). Через 40 минут измеряли оптическую плотность раствора В относительно раствора сравнения (готовили аналогично раствору В, но без добавления раствора алюминия хлорида) на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 400 нм (Ах) [2, 9-11].
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в листьях вербены лимонной (Х,%) вычисляли по формуле, используя значение удельного показателя поглощения лютеолина:
где: А - оптическая плотность исследуемого раствора;
А1см1% - удельный показатель поглощения комплекса лютеолина с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм, равный 549,41;
a - масса навеска сырья, г;
W - влажность сырья, %.
3. Основные результаты
Методом ТСХ в системе растворителей н-бутанол – кислота уксусная концентрированная – вода (4:1:2) в листьях вербены лимонной обнаружено наличие зон адсорбции 6 веществ флавоноидной структуры, из которых были идентифицированы рутин (0,82), апигенин (0,78) и лютеолин (0,57) (табл. 1).
Таблица 1 - Результаты хроматографического анализа флавоноидов в листьях вербены лимонной
Rf | Окраска зон адсорбции | Результаты идентификации/ предполагаемое вещество | ||
в видимом свете | в УФ-свете | в УФ при 365 нм свете после обработки NH3 | ||
0,44±0,03 | Коричневая | Коричневая | Коричневая | не идентифиц. |
0,57±0,02 | Коричневая | Темно-коричневая | Желто-коричневая | лютеолин |
0,63±0,03 | Коричневая | Коричневая | Коричневая | не идентифиц. |
0,79±0,02 | Светло-коричневая | Светло-бурая | Желтая | апигенин |
0,82±0,02 | Светло-коричневая | Светло-коричневая | Лимонно-желтая | рутин |
0,91±0,02 | Светло-коричневая | Светло-бурая | Оранжевая | не идентифиц. |
Наибольшей интенсивностью свечения характеризовалась зона адсорбции лютеолина, что позволило сделать вывод о преобладании в сырье данного вещества.
Спектры спиртовых извлечений из листьев вербены лимонной имели максимумы поглощения при длинах волн 286±2 нм и 333±2 нм, что свидетельствовало о присутствии в сырье помимо флавоноидов сопутствующих веществ (фенилпропаноида вербаскозида) [1], [2]. Мешающее влияние сопутствующих веществ нивелировали реакцией комплексообразования флавоноидов с раствором хлорида алюминия, дающей батохромный сдвиг спектра поглощения [2]. Дифференциальный спектр комплекса флавоноидов листьев вербены лимонной с алюминия хлоридом имел максимум поглощения при длине волны 400 нм, что соответствовало максимуму поглощению комплекса лютеолина с алюминия хлоридом, поэтому целесообразно было вести расчет количественного содержания суммы флавоноидов в сырье в пересчете на лютеолин.
Таблица 2 - Факторы, оказывающие влияние на выход суммы флавоноидов
Концентрация этанола, % об. | Соотношение сырья и экстрагента | Кратность экстракции | Время экстракции, мин | Содержание флавоноидов, % |
40 | 1:20 | 1 | 45 | 0,795 |
50 | 1:20 | 1 | 45 | 0,823 |
70 | 1:20 | 1 | 45 | 0,905 |
70 | 1:30 | 1 | 45 | 1,140 |
70 | 1:40 | 1 | 45 | 1,002 |
70 | 1:50 | 1 | 45 | 0,967 |
70 | 1:30 | 2 | 45, 45 | 1,274 |
70 | 1:30 | 3 | 45, 45, 45 | 1,406 |
Изучение факторов, влияющих на выход суммы флавоноидов из листьев вербены лимонной показало, что оптимальным является режим 3-кратной экстракции 70%-ным этиловым спиртом этиловым в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:30 (табл. 2).
На основании полученных результатов была предложена методика количественного анализа флавоноидов в исследуемом сырье и проведена ее валидационная оценка по параметрам линейность, прецизионность и правильность.
Для оценки линейности методики строили градуировочный график на 8 уровнях концентраций. Растворы готовили путем изменения объема аликвоты извлечения из листьев вербены лимонной. Концентрация флавоноидов в пересчете на лютеолин в анализируемых растворах составляла 0,005%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035% и 0,04% (табл. 3).
Таблица 3 - Результаты измерения оптической плотности
C, % | 0,005 | 0,01 | 0,015 | 0,02 | 0,025 | 0,03 | 0,035 | 0,04 |
А | 0,125 | 0,260 | 0,328 | 0,510 | 0,650 | 0,780 | 0,885 | 1,019 |
Рисунок 1 - Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов
В результате определения установлено, что график зависимости оптической плотности растворов от концентрации флавоноидов (рис.1) имеет линейный характер и описывается уравнением: y=25,87х-0,012. Коэффициент корреляции близок к единице и составляет 0,996, что свидетельствует об удовлетворительной линейности методики.
Установление прецизионности проводили по результатам анализа одного образца извлечения листьев вербены лимонной в 6 повторностях. Затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 4).
Таблица 4 - Результаты определения прецизионности
Навеска, г | Оптическая плотность | Найдено флавоноидов в пересчете на лютеолин (Х, %) | Метрологические характеристики |
0,984 | 0,700 | 1,381 | Хср =1,406% SD = 0,0143 RSD = 1,02% |
1,004 | 0,731 | 1,414 | |
0,988 | 0,724 | 1,423 | |
1,010 | 0,728 | 1,400 | |
1,000 | 0,725 | 1,408 | |
0,994 | 0,720 | 1,407 |
Из данных табл. 4 следует, что величина относительного стандартного отклонения составила 1,02%, что является удовлетворительным для данного метода.
Главным фактором, определяющим правильность методики, является значение систематической погрешности. Для определения правильности был выбран вариант, предлагаемый для биологических образцов, когда невозможно приготовить модельные смеси [10], [11], [12]. Правильность методики определяли методом добавок стандартного образца лютеолина к точной навеске сырья вербены лимонной (табл. 5). Для оценки полученных результатов использовали коэффициент открываемости (R), средняя величина которого должна находиться в пределах 100±5%. В разработанной методике критерий открываемости находился в пределах от 98,74% до 103,62%. Среднее его значение составило 100,95% (RSD=1,904%), что свидетельствует об удовлетворительной правильности методики количественного определения флавоноидов в листьях вербены лимонной.
Таблица 5 - Результаты определения правильности
№ п/п | Флаво- ноиды, % | Добавлено лютеолина к 1 г сырья | Содержание флавоноидов, % | R,% | Метрологические характеристики | |
Найдено | Расчет-ное | |||||
1 | 1,406 | 0,005 | 1,975 | 1,906 | 103,62 | R=100,95 |
2 | 1,406 | 0,0075 | 2,129 | 2,156 | 98,74 | |
3 | 1,406 | 0,01 | 2,432 | 2,406 | 101,08 | |
4 | 1,406 | 0,015 | 2,887 | 2,906 | 99,34 | |
5 | 1,406 | 0,02 | 3,411 | 3,406 | 100,15 | |
6 | 1,406 | 0,025 | 4,012 | 3,906 | 102,74 |
4. Заключение
В результате проведенного исследования нами установлено присутствие в листьях вербены лимонной флоры Марокко лютеолина, апигенина, рутина; предложены оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из сырья (3-кратная экстракции 70%-ным этиловым спиртом этиловым в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:30); разработана методика количественного определения флавоноидов в листьях Aloysia citriodora; проведена валидационная оценка разработанной методики, которая показала, что разработанная валидна по показателям линейность, воспроизводимость и правильность и пригодна для оценки качества листьев вербены лимонной.