АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА VEGFA (G-634C) ПРИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА VEGFA (G-634C) ПРИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ

Научная статья

Булатова И.А.^1, *, Мифтахова А.М.², Гуляева И.Л.³

¹ ORCID: 0000-0002-7802-4796;

² ORCID: 0000-0002-7802-4796;

³ ORCID: 0000-0001-7521-1732;

^{1, 2, 3} Пермский государственный медицинский университет им. ак. Е.А. Вагнера, Пермь, Россия

* Корреспондирующий автор (bula.1977[at]mail.ru)

Аннотация

Цель исследования. Изучить биохимические параметры, концентрацию васкулоэндотелиального фактора роста (ВЭФР) и однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) гена VEGFA в регионе -634G/C (rs2010963) у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБ).

Материал и методы. Исследовали функциональные печеночные тесты (трансаминазы и гамма-глутамилтранспептидазу), сывороточную концентрацию ВЭФР методом иммуноферментного анализа и ОНП гена VEGFA в регионе -634G/C методом ПЦР у 52 больных НАЖБ и 65 здоровых доноров.

Результаты. Уровень трансаминаз в сыворотке крови исследуемых групп не имел значимых различий. Небольшое повышение активности ГГТП (р=0,02) у больных НАЖБ свидетельствовало о наличие холестатического синдрома. Сывороточная концентрация ВЭФР в группе с НАЖБ в 2 раза превышала значения контроля (р=0,001). Гомозигота СС и аллель С гена VEGFA (G-634C) значимо чаще регистрировались в группе с НАЖБ, чем в группе контроля (р=0,02 и р=0,01 соответственно).

Заключение. Течение НАЖБ сопровождается повышением активности ГГТП и сывороточной концентрации ВЭФР. Риск развития стеатоза печени ассоциирован с носительством генотипа СС гена VEGFA -634G/C.

Ключевые слова: неалкогольная жировая болезнь печени, васкулоэндотелиальный фактор роста, полиморфизм генов.

AN ANALYSIS OF VEGFA (G-634C) GENE POLYMORPHISM IN NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE

Research article

Bulatova I.A.^1, *, Miftakhova A.M.², Gulyaeva I.L.³

¹ ORCID: 0000-0002-7802-4796;

² ORCID: 0000-0002-7802-4796;

³ ORCID: 0000-0001-7521-1732;

^{1, 2, 3} Perm State Medical University, Perm, Russia

* Corresponding author (bula.1977[at]mail.ru)

Abstract

The aim of the study is to To study the biochemical parameters, the concentration of vascular endothelial growth factor (VEGF) and single-nucleotide polymorphism (SNP) of the VEGFA gene in the region-634G/C (rs2010963) in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).

Material and methods. Functional liver tests (transaminases and gamma-glutamyltranspeptidase), the serum concentration of VEGF by enzyme immunoassay and the ONP of the VEGFA gene in the region-634G/C were studied in 52 patients with NAFLD and 65 healthy donors via PCR.

Results. The level of transaminases in the blood serum of the studied groups did not have significant differences. A slight increase in the activity of GGTP (p=0.02) in patients with NAFLD point to cholestatic syndrome. The serum concentration of VEFR in the group with NAFLD was 2 times higher compared to the control values (p=0.001). The CC homozygote and the VEGFA allele C (G-634C) were significantly more often registered in the group with NAFLD than in the control group (p=0.02 and p=0.01, respectively).

Conclusion. The course of NAFLD is accompanied by an increase in the activity of gamma-glutamyltransferase and the serum concentration of VEFR. The risk of developing liver steatosis is associated with the carrier of the CC genotype of the VEGFA-634G/C gene.

Keywords: non-alcoholic fatty liver disease, vascular endothelial growth factor, gene polymorphism.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБ), в большинстве случаев представленная стеатозом, встречается у 20-33% взрослого населения в мире. Распространенность НАЖБ в России составляет 37,1%, у пациентов с ожирением достигает 95% [1, С. 24].

Васкулоэндотелиальный фактор роста (ВЭФР) стимулирует продукцию коллагена звёздчатыми клетками печени при воспалении и процессы неоангиогенеза, что ведет к прогрессированию заболеваний печени [2], [3], [4], [5]. В моделях фиброза и стеатоза на животных ВЭФР способствовал развитию фиброза в печени [6], [7].

Перспективной направлением является оценка роли генетических факторов в развитии заболеваний, что позволит проводить профилактику и индивидуализировать терапию.

Цель исследования. Изучить биохимические параметры, концентрацию васкулоэндотелиального фактора роста (ВЭФР) и однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) гена VEGFA в регионе -634G/C (rs2010963) у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени.

Методы и принципы исследования

В исследовании приняли участие 52 пациента с НАЖБ с клинической формой стеатоза печени средним возрастом 43,0±11,1, из них женщин 35 человек, мужчин – 17. Стеатоз печени определяли на основании УЗИ при наличии следующих признаков: диффузная гиперэхогенность печени, увеличение эхогенности печени по сравнению с почками, дистальное затухание эхосигнала, обеднение сосудистого рисунка. Критерии включения в исследование: мужчины и женщины старше 18 лет, давшие письменное информированное согласие на участие в исследовании, имеющие НАЖБ (клиническая форма неалкогольный стеатоз печени), подтвержденным с помощью инструментального метода (УЗИ печени). Критерии исключения: беременность и период лактации, хронические сопутствующие заболевания в стадии обострения или декомпенсации, злокачественные новообразования, аутоиммунные процессы, инфекционные и психические заболевания, сахарный диабет, жировой гепатоз другой этиологии (лекарственной и алкогольной), вирусные и токсические поражения печени, а также исключали больных с неалкогольным стеатогепатитом, который устанавливался оценкой уровня трансаминаз в сыворотке крови.

Группа контроля состояла из 65 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту, не имеющих заболеваний гепатобилиарной системы, у 20 из которых оценивали функциональные печеночные тесты и концентрацию ВЭФР и у всей группы ОНП гена VEGFA (G-634C). Все участники исследования получили полную информацию об исследовании и подписали добровольное информированное согласие.

Биохимические показатели: аланинаминотрансферазу (АЛТ), аспартатаминотрансферазу (АСТ) и гамма-глутамилтранспептидазу (ГГТП) в сыворотке крови исследовали на автоматическом анализаторе «Architect-4000» (США) с использованием реагентов фирмы «Abbott Laboratories» (США). Концентрацию ВЭФР в сыворотке крови исследуемых лиц определяли методом иммуноферментного анализа на фотометре «Stat-Fax 2100» (США) с применением реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Исследование однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) гена VEGFA в регионе -634G/C проводили методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе Real-time «CFХ-96» («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) с применением аллель-специфической ПЦР "SNP-Скрин" (ЗАО «Синтол», г. Москва). Для выявления ОНП методом ПЦР-РВ суммарную ДНК выделяли из образцов цельной венозной крови, предварительно стабилизированной ЭДТА с использованием набора «ДНК-Сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва).

Статистическую обработку данных проводили в программе «STATISTICA 7.0». Количественные параметры представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25% – 75%) с оценкой значимости различий с помощью критерия Манна-Уитни. Соотношение частот генотипов и аллелей ОНП гена определяли методом χ2 с расчетом отношения шансов (OR). Различия между выборками считались достоверными при значении для р<0,05.

Основные результаты

Пациенты с НАЖБ при опросе в 80% предъявляли жалобы на тяжесть в правом подреберье и периодически возникающие явления диспепсии.

По данным лабораторных тестов уровень трансаминаз в сыворотке крови исследуемых групп не имел значимых различий, что свидетельствует об отсутствии цитолиза у пациентов с НАЖБ. Небольшое повышение активности ГГТП (р=0,02) свидетельствует о наличие холестатического синдрома при стеатозе печени (см. таблицу 1).

 

Таблица 1 – Биохимические параметры и концентрация ВЭФР в контрольной группе и у пациентов с НАЖБ

Показатель	Контроль	НАЖБ	p
АЛТ, Ед/л	19,4 (14,5; 27,8)	19 (14; 28,7)	0,34
АСТ, Ед/л	19 (17,9; 26,2)	20 (17; 26)	0,33
ГГТП, Ед/л	10,8 (9,9; 14,9)	20,5 (14,8; 31,7)	0,02*
ВЭФР, пг/мл	86,65 (10,7; 132,4)	184,6 (94,7; 291,6)	0,001*

Примечание: р – значимость различий; * – статистически значимые различия  

Согласно Российским Клиническим рекомендациям у пациентов с НАЖБ иногда выявляют повышение активности сывороточных трансаминаз, обычно не превышающих верхнюю границу нормальных значений более чем в 4–5 раз. Активность ГГТП в крови у большинства пациентов, как правило, повышена не более чем в 2 раза, а у некоторых из них это может быть единственным отклонением в биохимическом анализе [1, С. 30].

Сывороточная концентрация ВЭФР у пациентов с НАЖБ в 2 раза превышала значения группы контроля (р=0,001) (см. таблицу 1). Таким образом, течение НАЖБ сопровождается слабовыраженным синдромом холестаза и гиперпродукцией ВЭФР.

При изучении ОНП гена VEGFA (G-634C) в позиции rs2010963 у здоровых преобладал генотип GС в 35,38% (χ2=7,71; р=0,04). Однако, гомозигота СС обнаруживалась значимо чаще в когорте больных НАЖБ – в 28,85% случаев с высокой вероятностью (ОR=3,36), а у здоровых обнаруживалась лишь в 10,77% (χ2=6,18; р=0,02). Аллель С гена VEGFA в регионе -634G/C у больных НАЖБ регистрировался в 54,81%, что было значимо выше, чем у доноров (χ2=6,83; р=0,01; ОR=2,00) (см. рисунок 1).

Рис. 1 – Частота обнаружения аллельных вариаций гена VEGFA в регионе -634G/C в позиции rs2010963 в группах доноров и больных НАЖБ.

Примечание: % - частота встречаемости аллельных вариаций ОНП гена VEGFA; * – статистически значимые различия в группах доноров и больных НАЖБ

 

Таким образом, можно предположить, что аллель С в локусе гена VEGFA (G-634C) может являться предиктором развития НАЖБ.

Обсуждение

Васкулоэндотелиальный фактор роста вырабатывается эндотелиоцитами и макрофагами, является важным регулятором процессов ангиогенеза и васкулогенеза, маркером повреждения эндотелия и стимулятором фиброгенеза. Нарушения внутрипеченочной гемодинамики при патологии печени нередко связывают с повреждением эндотелиальной выстилки синусоидов [2], [3], [4], [5].

В литературе есть данные о повышении концентрации ВЭФР при вирусных гепатитах и циррозе печени [8], [9]. Многие исследователи сходятся во мнении, что гиперпродукция ВЭФР имеет место при стеатогепатите, в то время как при стеатозе печени достоверное повышение маркеров повреждения и дисфункции эндотелия подтверждено только в части исследований. В одном из исследований уровень ВЭФР в группе пациентов со стеатозом печени был значимо выше относительно контроля, а при стеатогепатите относительно контроля разница по уровню ВЭФР приближалась к статистически значимой. При этом отличий по ВЭФР между больными с клиническими формами стеатоза и стеатогепатита не было выявлено. Однако после коррекции по полу, возрасту и гистологии уровень ВЭФР приобрел пограничную значимость для всех групп [10].

В другом из недавних исследований сообщается, что системная блокада ВЭФР рецепторов-3 у мышей приводила к уменьшению инфильтрации жировой ткани макрофагами и снижению накопления жиров в печени, а также способствовала улучшению чувствительности к инсулину [11, С. 93].

Ряд исследователей подтвердили наличие дисфункции эндотелия при НАЖБ не только биохимическими, но и функциональными методами [12], [13].

Риск развития НАЖБ ассоциирован с аллелью С в локусе гена VEGFA (G-634C). В наших предыдущих исследованиях была показана его значимость при хронизации заболеваний печени вирусной этиологии [14]. Однако при анализе ОНП генов следует учитывать региональные и популяционные особенности, а также расовую принадлежность.

Заключение

Течение НАЖБ сопровождается повышением активности ГГТП и сывороточной концентрации ВЭФР. Риск развития стеатоза печени ассоциирован с носительством генотипа СС гена VEGFA -634G/C.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Ивашкин В.Т. Клинические рекомендации по диагностике и лечению неалкогольной жировой болезни печени Российского общества по изучению печени и Российской гастроэнтерологической ассоциации / В.Т. Ивашкин, М.В. Маевская, Ч.С. Павлов и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2016. - №2. – С.24-42.
2. Мехтиев С. Н. Современные представления о фиброзе печени и методах его коррекции / С.Н. Мехтиев, В.В. Степаненко, Е.Н. Зиновьева и др. // Фарматека. – 2014. - №6. – С. 80-87.
3. Park S. Differential Roles of Angiogenesis in the Induction of Fibrogenesis and the Resolution of Fibrosis in Liver / S. Park, J.W. Kim, J.H. Kim // Biol Pharm Bull. – 2015. – Vol. 38. - №7. - P. 980-985.
4. Couter J. Le. Angiogenesis-independent endothelial protection of liver: role of VEGF / J. Le. Couter, D. R. Moritz, G. L. Phillips et al. // Science. – 2003. - № 299. – P. 890-893.
5. Wynn, А. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis / А. Wynn // J. Pathol. - 2008. - № 214. - P. 199-210.
6. Yang L. Vascular Endothelial Growth Factor Promotes Fibrosis Resolution and Repair in Mice / L.Yang, J. Kwon, Y. Popov et al. // Gastroenterology. – 2014. – Vol. 146. - № 5. – P. 1339-1350.
7. Драпкина О. М. Оценка эндотелиальной функции и степени апоптоза у пациентов с метаболическим синдромом и неалкогольной жировой болезнью печени / О.М. Драпкина, Т.А. Деева, В.Т. Ивашкин // Терапевтический архив. – 2015. - №5 (87). – С. 76-83.
8. Щёкотов В. В. Взаимосвязь маркеров эндотелиальной дисфункции и фиброза при хроническом гепатите и циррозе печени / В. В. Щекотов, А. П. Щекотова, И. А. Булатова // Клиницист. – 2011. – № 3. – С. 68-73.
9. Чистякова М.В. Функциональное состояние эндотелия у пациентов с вирусным гепатитом и циррозом печени / М.В. Чистякова, А.В. Говорин, Е.В. Радаева // Казанский медицинский журнал. - 2014. - №1 (95). - C. 41-45.
10. Coulon S. Evaluation of inflammatory and angiogenic factors in patients with non-alcoholic fatty liver disease / S. Coulon, S. Francque, I. Colle et al. // Cytokine. – 2012. – №59. – P. 442-449.
11. Karaman S. Blockade of VEGF-C and VEGF-D modulates adipose tissue inflammation and improves metabolic parameters under high-fat diet / S. Karaman, M. Hollmén, M.R. Robciuc et al. // Mol. Metab. – 2014. – Vol. 4. - №2. – P. 93-105.
12. Пивторак Е.В. Нарушения функции эндотелия у больных неалкогольной жировой болезнью печени / Е.В. Пивторак // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2014. – № 2. – С. 63.
13. Cetindaglı I. Evaluation of endothelial dysfunction in patients with nonalcoholic fatty liver disease: Association of selenoprotein P with carotid intima-media thickness and endothelium-dependent vasodilation / I. Cetindaglı, M. Kara, A. Tanoglu et al. // Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. – 2017. – Vol. 28. - № 3. - P. 290-291.
14. Булатова И.А. Васкулоэндотелиальный фактор роста и полиморфизм гена VEGF (rs2010963) в патогенезе хронического вирусного гепатита С / И.А. Булатова // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6. – [Электронный ресурс]. URL: http://www.science-education.ru/113-11340 (дата обращения: 13.07.2021).

Список литературы на английском языке / References in English

1. Ivashkin V.T. Klinicheskie rekomendatsii po diagnostike i lecheniyu nealkogol'noy zhirovoy bolezni pecheni Rossiyskogo obshchestva po izucheniyu pecheni i Rossiyskoy gastroenterologicheskoy assotsiatsii [Clinical guidelines for the diagnosis and treatment of non-alcoholic fatty liver disease of the Russian Society for the Study of the Liver and the Russian Gastroenterological Association] /V.T. Ivashkin M.V. Maevskaya, Ch.S. Pavlov et al. // Rossiyskiy zhurnal gastroenterologii, gepatologii i koloproktologii [Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology and Coloproctology] - 2016. - №2. – P.24-42. [in Russian]
2. Mekhtiev S. N. Sovremennye predstavleniya o fibroze pecheni i metodakh ego korrektsii [Modern concepts of liver fibrosis and methods of its correction] / S.N. Mekhtiev, V.V. Stepanenko, E.N. Zinov'eva et al. // Farmateka [Pharmateca]. – 2014. - №6. – P. 80-87. [in Russian]
3. Park S. Differential Roles of Angiogenesis in the Induction of Fibrogenesis and the Resolution of Fibrosis in Liver / S. Park, J.W. Kim, J.H. Kim // Biol Pharm Bull. – 2015. – Vol. 38. - №7. - P. 980-985.
4. Couter J. Le. Angiogenesis-independent endothelial protection of liver: role of VEGF / J. Le. Couter, D. R. Moritz, G. L. Phillips et al. // Science. – 2003. - № 299. – P. 890-893.
5. Wynn, А. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis / А. Wynn // J. Pathol. - 2008. - № 214. - P. 199-210.
6. Yang L. Vascular Endothelial Growth Factor Promotes Fibrosis Resolution and Repair in Mice / L.Yang, J. Kwon, Y. Popov et al. // Gastroenterology. – 2014. – Vol. 146. - № 5. – P. 1339-1350.
7. Drapkina O. M. Otsenka endotelial'noy funktsii i stepeni apoptoza u patsientov s metabolicheskim sindromom i nealkogol'noy zhirovoy bolezn'yu pecheni [Assessment of endothelial function and the degree of apoptosis in patients with metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease] / O.M. Drapkina, T.A. Deeva, V.T. Ivashkin // Terapevticheskiy arkhiv [Therapeutic archive]. – 2015. - №5 (87). – P. 76-83. [in Russian]
8. Shchekotov V. V. Vzaimosvyaz' markerov endotelial'noy disfunktsii i fibroza pri khronicheskom gepatite i tsirroze pecheni [Evaluation of endothelial function and the degree of apoptosis in patients with metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease] / V. V. Shchekotov, A. P. Shchekotova, I. A. Bulatova // Klinitsist. – 2011. – № 3. – Р. 68-73. [in Russian]
9. Chistyakova M.V. Funktsional'noe sostoyanie endoteliya u patsientov s virusnym gepatitom i tsirrozom pecheni [Functional state of the endothelium in patients with viral hepatitis and cirrhosis of the liver] / M.V. Chistyakova, A.V. Govorin, E.V. Radaeva // Kazanskiy meditsinskiy zhurnal. - 2014. - №1 (95). - Р. 41-45. [in Russian]
10. Coulon S. Evaluation of inflammatory and angiogenic factors in patients with non-alcoholic fatty liver disease / S. Coulon, S. Francque, I. Colle et al. // Cytokine. – 2012. – №59. – P. 442-449.
11. Karaman S. Blockade of VEGF-C and VEGF-D modulates adipose tissue inflammation and improves metabolic parameters under high-fat diet / S. Karaman, M. Hollmén, M.R. Robciuc et al. // Mol. Metab. – 2014. – Vol. 4. - №2. – P. 93-105.
12. Pivtorak E.V. Narusheniya funktsii endoteliya u bol'nykh nealkogol'noy zhirovoy bolezn'yu pecheni [Endothelial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease] / E.V. Pivtorak// Eksperimental'naya i klinicheskaya gastroenterologiya [Experimental and Clinical Gastroenterology]. – 2014. – № 2. – P. 63. [in Russian]
13. Cetindaglı I. Evaluation of endothelial dysfunction in patients with nonalcoholic fatty liver disease: Association of selenoprotein P with carotid intima-media thickness and endothelium-dependent vasodilation / I. Cetindaglı, M. Kara, A. Tanoglu et al. // Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. – 2017. – Vol. 28. - № 3. - P. 290-291.
14. Bulatova I.A. Vaskuloendotelial'nyy faktor rosta i polimorfizm gena VEGF (rs2010963) v patogeneze khronicheskogo virusnogo gepatita S [Vasculoendothelial growth factor and VEGF gene polymorphism (rs2010963) in the pathogenesis of chronic viral hepatitis C] [Electronic resource] / I.A. Bulatova // Modern problems of science and education. – 2013. – № 6. – URL: http://www.science-education.ru/113-11340 (accessed: 13.07.2021). [in Russian]