ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ DROSOPHILA FUNEBRIS

ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ DROSOPHILA FUNEBRIS

Научная статья

Булыгин А.А.¹, Пастухова Е.И.^2, *

¹ ORCID: 0000-0002-6689-4647;

² ORCID: 0000-0003-4107-5669;

^{1, 2} ФГБОУ ВО Челябинский государственный университет, Челябинск, Россия

* Корреспондирующий автор (pastuel[at]ya.ru)

Аннотация

Старение является неизбежным процессом, заключающимся в снижении функциональности организма. Предельное снижение функциональности в итоге приводит к болезням и смерти. Поэтому проблема старения в наше время очень актуальна. Её изучают на разных уровнях: от молекулярного до популяционного. Одной из моделей для изучения продолжительности жизни являются мухи Drosophila, самым известным видом которых является D. melanogaster. В нашей работе мы покажем, что с тем же успехом для опытов на продолжительность жизни может быть использован вид D. funebris.

Ключевые слова: продолжительность жизни, разведение, оптимальные условия, дрозофила большая, модельный объект.

MEASURING THE LIFE EXPECTANCY OF DROSOPHILA FUNEBRIS

Research article

Bulygin A.A.¹, Pastukhova E.I.^2, *

¹ ORCID: 0000-0002-6689-4647;

² ORCID: 0000-0003-4107-5669;

^{1, 2} FSBEI HE Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia

* Corresponding author (pastuel[at]ya.ru)

Abstract

Aging is an inevitable process, which involves the reduction of body functionality. The ultimate decrease in functionality leads to illness and death. Therefore, the problem of aging is relevant. It is studied at different levels: from molecular to the population level. One of the models for studying life expectancy is the use of Drosophila flies, the most famous of which is called D. melanogaster. In our work, we show that D. funebris species can be also be successfully used for the study of life expectancy.

Keywords: life expectancy, breeding, ideal conditions, Drosophila funebris, model object.

Введение

Drosophila funebris – давно известный вид мух семейства Drosophilidae. Первые его исследования начали проводиться в 20-ых годах прошлого века после того, как Стёртевант привёл первое описание в 1921 году [1].

Но работ, в которых бы изучались какие-либо общие свойства данного вида, с того времени было немного. В работах [2], [3] содержится лишь небольшое количество данных о его условиях развития и жизни. Намного большее внимание было уделено D. melanogaster [4], [5], [6], но при попытке в точности применить для D. funebris методику из данных работ очень быстро возникают проблемы, решение которых требует учёта особенностей D. funebris. Здесь мы подробно опишем нашу методику подготовки и проведения опыта на продолжительность жизни D. funebris.

Методы и принципы исследования

Приготовление среды для разведения мух начинается с определения необходимого количества каждого из составляющих. Мы используем следующий рецепт: 1 л дистиллированной воды, 13 г агара, 107 г прессованных дрожжей, по 37 г сахара и манки и 3 мл пропионовой кислоты [7]. После варки среда остужается примерно до 60⁰C для добавления консерванта, например – пропионовой кислоты. Более высокая температура будет означать большее испарение кислоты. После разлива среды пробирки затыкают ватными затычками, обожжёнными над спиртовкой.

Количество среды, разливаемое в пробирки, зависит от конкретных целей. Если нужно получить потомство от одной пары особей, то достаточным будет 4-5 мл в пробирке объёмом 15 мл (рис. 1). При большом количестве особей для избежания перенаселения личинками стоит рассчитывать 1 мл на одну самку. Для обычного поддержания линий данное соотношение можно уменьшить вдвое.

Несмотря на бо́льшую терпимость личинок D. funebris, нежели D. melanogaster, к качеству среды [3], перенаселение всё же заметно сказывается на размерах тела взрослых мух, и как следствие на других показателях, в том числе и на продолжительности жизни. Для 15 мл пробирок мы считаем перенаселением случай, когда образуется больше 90 куколок. При количестве куколок больше 110 уже очень заметно снижается доля вылупляющихся мух и их масса. Оптимальным же количеством, по нашему мнению, является 50-70 куколок.

 

Рис. 1 – Пробирки для разведения мух

 

В опытах на собственно продолжительность жизни достаточно, чтобы слой среды в пробирке был не меньше 5 мм. Но при повышенных температурах содержания (выше 25⁰C) имеет смысл наливать 7-8 мм среды для предотвращения её высыхания.

В качестве еды для взрослых мух используются те же дрожжи, разведённые в дистиллированной воде. Консистенция при этом должна напоминать молочную. Дрожжи наносят на поверхность среды кисточкой, простерилизованной кипячением. Важно, чтобы при смазывании не переносилось много жидкости на среду, иначе мухи могут увязнуть. Если смазывается свежеприготовленная среда, то стоит оставить её в холодильнике на сутки, так как намазанные дрожжи в таком случае высыхают дольше.

Для изучения яиц используются чашки Петри с агарозной средой. Её рецепт проще: агар, вода и сахар в тех же пропорциях. На одну чашку уходит по 20 мл среды. Яйца имеют белый цвет, поэтому для того, чтобы их увидеть, можно, например, добавлять в среду краситель (из натуральных хорошо подходят ягоды жимолости или черники). Среду в чашках также стоит смазать дрожжами, так как большинство яиц даже оплодотворённые самки D. funebris откладывают только через сутки после посадки.

Для измерения продолжительности жизни необходимо получить требуемое по условиям опыта количество одновозрастных имаго. Для этого в пробирки с 5 мл среды помещается 5-6 пар родителей. При оптимальных условиях можно ожидать одномоментного вылета 20-30 потомков в день.

Спаривание у D. funebris происходит только на 3-4 день после вылупления [3], что заметно больше, чем у D. melanogaster. Тем не менее, если для опыта нужны девственные мухи, их стоит изолировать уже после первого дня. При отборе по полу следует использовать бинокуляр или хорошую лупу, т.к. только так можно различить половые органы самцов и самок D. funebris.

Усыпление можно проводить разными методами. Самым простым является усыпление диэтиловым эфиром. Для этого девственных мух вытряхивают в морилку – специальную пробирку, закрывающуюся пробкой с куском ваты. На вату капают эфир, закрывают морилку и ждут засыпания. Время ожидания зависит от объёма морилки и количества мух. Оно больше, чем у D. melanogaster, и составляет 50-60 секунд для нескольких десятков мух в 15 мл морилке.

После усыпления мухи вытряхиваются на рабочую зону бинокуляра, а после определения пола пинцетом переносятся в свежие пробирки, которые оставляют на боку до момента восстановления мух (5-10 мин). В пробирку объёмом 15 мл с 2 мл среды стоит помещать не больше 5 мух. Используя бо́льшие пробирки, нужно исходить из расчёта отношения количество мух/площадь поверхности среды. Перетряхивание на новую среду, как и в случае с D. melanogaster, достаточно проводить два раза в неделю с промежутками не больше трёх дней.

При проведении опыта на продолжительность жизни мы рекомендуем заносить в табличный редактор столбец данных с датами начала опыта и смертей/потерь мух. Из этих данных легко получить времена жизни мух. Напротив этого столбца данных следует иметь столбец с индикаторами цензурирования: обычно это «1» для смерти и «0» для потери. Цензурирование позволяет учитывать потерянных мух для уточнения расчётов, а также позволяет прекратить опыт до смерти всех мух. В последнем случае рекомендуется установить одну продолжительность опыта для всех линий и всех серий. Тем не менее лучшим вариантом является продолжение опыта до гибели последней особи.

Анализ данных мы проводим в бесплатной программе Past 3.16 (рис. 2). Для построения кривой выживаемости Каплана-Мейера [8] эта программа требует на вход массив данных из двух столбцов: времена жизни и индикаторы цензурирования. Выделив эти два столбца или больше для большего количества линий, можно построить график, как на рисунке 2.

 

Рис. 2 – Построение кривых выживаемости в Past

 

Для определения статистической значимости различий между кривыми рекомендуют использовать лог-ранговый тест, так как другие два завышают значимость ранних смертей. Для более подробной информации по этому поводу можно обратиться к инструкции пользователя Past или к другой соответствующей литературе [9], [10].

Заключение

Опыт по определению продолжительности жизни D. funebris лёгок в понимании, но сложен в исполнении. Ключевыми факторами успешного эксперимента по измерению продолжительности жизни у D. funebris являются: 1) одномоментное получение достаточного количества одновозрастных мух; 2) оптимальные и постоянные температурные условия; 3) достаточное питание и влажность; 4) регулярная пересадка на свежую среду желательно без потерь; 5) продолжение опыта до гибели последней особи; 6) анализ полученных данных с применением подходящего статистического критерия. При соблюдении всех правил содержания D. funebris могут быть успешно использованы для опытов на продолжительность жизни и многих других.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Sturtevant A.H. The North American Species of Drosophila / A.H. Sturtevant // Nature. – 1921. – V. 107, №2702. – P. 743.
2. Perje A.M. Genetic and cytological studies of Drosophila funebris. Some sex-linked mutations and their standard order / A.-M. Perjie // Acta zoological. – 1955. – V. 36, №1. – P. 51-66.
3. Stalker H.D. Four New Species of Drosophila, with Notes on the Funebris Group / H.D. Stalker, W.P. Spencer // Ann Entomol Soc Am. – 1939. – V. 32, №1. – P. 105-112.
4. Linford N.J. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster / N.J. Linford, C. Bilgir, J. Ro [et al.] // J Vis Exp. – 2013. – №71. e50068, Doi: 10.3791/50068
5. Bauer J.H. Dominant-negative Dmp53 extends life span through the dTOR pathway in melanogaster / J.H. Bauer, C. Chang, G. Bae and others // Mech Ageing Dev. – 2010. – V. 131, №3. – P. 193-201.
6. Economos A.C. Developmental Temperature and Life Span in Drosophila melanogaster / A.C. Economos, F.A. Lints // Gerontology. – 1986. – V. 32, №1. – P. 18-27.
7. Lewis E.B. A new standard food medium / E.B. Lewis // Drosophila Information Service. – 1960. – №34. – P. 117-118.
8. Kaplan, E.L. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations / E.L. Kaplan, P. Meier // Journal of the American Statistical Association. 1958. – №53. – P. 457-481.
9. Cox D.R. Analysis of Survival Data / D.R. Cox, D. Oakes. New York: Chapman & Hall. 1984. 212 pp.
10. Petrie A. Medical Statistics at a Glance / A. Petrie, C. Sabin. Wiley-Blackwell. 2009. 183 pp.