ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕТОТРЕКСАТА НА ФОРМИРОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА В ХИМИЧЕСКОМ СИНТЕЗЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕТОТРЕКСАТА НА ФОРМИРОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА В ХИМИЧЕСКОМ СИНТЕЗЕ
Аннотация
Метотрексат (МТХ) является одним из популярных препаратов для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний, однако, может приводить к серьезным, потенциально опасным для жизни побочным эффектам. В связи с этим возникает проблема как терапевтического мониторинга концентраций препарата в органах и тканях, позволяющая подбирать оптимальную дозу препарата, так и задача адресной доставки метотрексата к мишени. Это влечет за собой исследование фундаментальных механизмов формирования комплекса МТХ-наночастицы золота. Выбор золотых наночастиц (ЗНЧ) обусловлен их уникальными характеристиками такими как плазмонный резонанс, химическая инертность и эффективная сорбция. В данной работе исследовано влияние МТХ на образование наночастиц золота при химическом осаждении. Методом химического синтеза в присутствии МТХ и боргидрида натрия получены коллоидные растворы золота, показано влияние МТХ на стабильность растворов. Физико-химические свойства ЗНЧ, исследованные с помощью спектрофотометрии (анализ спектров поглощения), электронной спектроскопии (морфология и размеры) и измерения гидродинамического радиуса и дзета-потенциала (оценка стабильности), подтвердили влияние метотрексата на формирование наночастиц золота. Полученные результаты демонстрируют потенциал для дальнейшего изучения комплексов метотрексата с кластерами золота с целью детального исследования образования композитных агрегатов, полученных при взаимодействии ЗНЧ и МТХ.
1. Введение
Наночастицы золота традиционно используются в тераностике из-за наличия установленных фототермических свойств, простоты функционализации поверхности различными органическими агентами, возможности индуцирования эффекта поверхностного плазмонного резонанса, который может модулироваться формой, размером, составом и свойствами поверхности наночастиц
. Свойства локализованного поверхностного плазмонного резонанса золотых наночастиц используют при создании зондов . Такой широкий спектр физических и химических свойств золотых наночастиц обусловлен различием в формах и размерах, которые легко варьируются при синтезе . Наиболее распространенными побочными эффектами метотрексата являются желудочно-кишечные расстройства, в то время как легочная токсичность и гепатотоксичность вызывают серьезные осложнения . Нефротоксичность, вызванная высокими дозами метотрексата, является серьезным осложнением и возникает из-за накопления MTX и его метаболитов в почечных канальцах или прямого повреждения этих канальцев . Это серьезная проблема, учитывая, что частота возникновения почечной токсичности составляет 9,1% у пациентов с лимфомами, в то время как у пациентов с саркомами она составляет 1,5% . Кроме того, MTX может вызывать нейротоксичность, влияя на центральную нервную систему посредством прямого повреждения и вмешательства в метаболические пути . Кроме того, введение высоких доз метотрексата может привести к подавлению костного мозга и повышенному риску инфекции . Токсичность и эффективность MTX варьируется, и реакция пациентов на лечение различается даже при одинаковых дозах , . Кроме того, токсичность сохраняется из-за меж- и внутрииндивидуальной вариабельности фармакокинетики этого препарата . Эти эффекты подчеркивают важность терапевтического лекарственного мониторинга и профилактических мер при использовании высоких доз метотрексата для минимизации токсичности.Ранее в литературе были описаны методы детекции МТХ с применением ЗНЧ, полученных как классическими методами восстановления в растворе (по Туркевичу и Френсу с различными модификациями
, , ), так и методом криохимического синтеза из паров металла . В данных работах включал стадию синтеза стабильных коллоидов золота с последующей их функционализацией молекулами МТХ. Полученные нанокомпозиты были охарактеризованы в том числе и с помощью абсорбционной спектроскопии для подтверждения образования связи и оценки стабильности системы по смещению пика поверхностного плазмонного резонанса (ППР).В настоящей работе проведен химический синтез ЗНЧ с непосредственным введением МТХ в реакционную смесь, исследованы физико-химических свойств МТХ и ЗНЧ, а также их комплексов. Оценены морфология, оптические свойства и стабильность таких систем.
2. Материалы и методы
2.1. Реагенты
Натрий гидроокись, хч, 1 кг, ГОСТ 4328-77, Натрий лимоннокислый 5,5 — водный, чда, 0,5 кг ГОСТ 2280-76, Натрий боргидрид, не менее 95%, 0,1 кг, ТУ 1-92-162-90, соляная кислота были приобретены в Ленреактив (Россия, Санкт-Петербург). Метотрексат (Methotrexate, Pharmaceutical Secondary Standard, PHR1396-1G) приобретен у Sigma-Aldrich. Кислота золотохлористоводородная водная приобретена в ОАО «Аурат» (Россия, Москва). Для всех процедур использовалась деионизированная вода (18,2 МОм). Все реактивы были аналитической чистоты и использовались без дополнительной очистки.
2.2. Синтез наночастиц золота с цитратом натрия (ЗНЧ-Цит)
Наночастицы были синтезированы с использованием цитрата натрия в качестве стабилизатора и боргидрида натрия как восстановителя. Смесь тетрахлораурата (III) (20 мл, 2.5·10-4 M), цитрата натрия (200 мкл, 10-2 M) и боргидрида натрия (600 мкл, 10-2 M) перемешивали (600 об./мин) при комнатной температуре (22±1° C). Цвет раствора изменился с бесцветного на темно-малиновый, рН раствора составил 6,5. Через 5 минут раствор центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 минут. Затем осадок промывали деионизированной водой, диспергировали в 5 мл воды и снова центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 минут. Для разрушения агрегатов наночастиц был добавлен раствор соляной кислоты (500 мкл, 1 M) до значения рН равного 2,5.
2.3. Синтез наночастиц золота с метотрексатом (ЗНЧ-МТХ)
Наночастицы были синтезированы по методике, описанной выше, с одним отличием: заменой цитрата натрия на МТХ для одностадийного синтеза наночастиц, поверхность которых модифицирована молекулами МТХ. Остальные параметры синтеза: добавление боргидрида как восстановителя, температурный режим и скорость перемешивания, остались без изменения. Смесь тетрахлораурата (III) (20 мл, 2.5·10-4 M), метотрексата (200 мкл, 10-2 M) и боргидрида натрия (600 мкл, 10-2 M) перемешивали (600 об./мин) при комнатной температуре (22±1° C). Цвет раствора изменился с бесцветного на темно-серый, рН раствора составил 7. Через 5 минут раствор центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 минут. Затем осадок промывали деионизированной водой, диспергировали в 5 мл воды и снова центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 минут. Для разрушения агрегатов наночастиц был добавлен раствор соляной кислоты (500 мкл, 1 M). При этом рН раствора составил 2,5.
2.4. Синтез наночастиц золота с цитратом натрия и метотрексатом (ЗНЧ-Цит-МТХ)
Наночастицы были синтезированы с использованием цитрата натрия в качестве стабилизатора и боргидрида натрия как восстановителя, так же в реакционную смесь добавлен МТХ. Смесь тетрахлораурата (III) (20 мл, 2.5·10-4 M), цитрата натрия (200 мкл, 10-2 M), боргидрида натрия (600 мкл, 10-2 M) и МТХ (200 мкл, 10-2 M) перемешивали (600 об./мин) при комнатной температуре (22±1° C). Цвет раствора изменился с бесцветного на темно-зеленый, рН раствора составил 6,5. Через 5 минут раствор центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 минут. Затем осадок промывали деионизированной водой, диспергировали в 5 мл воды. Далее раствор снова центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 минут, сливали надосадочную жидкость и диспергировали в 5 мл деионизированной воды. Для разрушения агрегатов наночастиц был добавлен раствор соляной кислоты (200 мкл, 1 M), значение рН составило 3.
Полученные растворы наночастиц образовали коллоидный раствор, стабильный в течение одной недели. Раствор сразу же был отправлен на характеризацию.
2.5. Характеризация наночастиц золота
Спектры поглощения наночастиц и раствора МТХ регистрировали с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-2600 (Shimadzu, Япония).
Гидродинамический размер и дзета-потенциал наночастиц в воде измеряли на установке Photocor Compact-Z (Фотокор, Россия). Для этого использовали термостабилизированный диодный лазер с длиной волны 659 нм (мощностью 25 мВт), универсальный адаптер из фторопласта со стекло-углеродными электродами.
Морфология и размерные характеристики синтезированных наночастиц исследовались методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) высокого разрешения с использованием электронной колонны двухлучевой системы Zeiss Crossbeam 540 (Carl Zeiss AG, Германия). Для обеспечения максимальной достоверности визуализации наноструктур в их исходном состоянии был применен специализированный протокол подготовки образцов. С целью минимизации неконтролируемой агрегации наночастиц из-за капиллярных эффектов при испарении, удаление жидкой фазы проводилось методом контролируемой вакуумной сушки в шлюзовой камере микроскопа при давлении ~0,2 мбар в течение 5 минут. Исследование проводилось без нанесения токопроводящих покрытий (углерода или благородных металлов). СЭМ-микрофотографии были получены при ускоряющем напряжении 5 кВ и токе электронного зонда 150 пА. Данные параметры обеспечили оптимальный баланс между достижением высокого пространственного разрешения и предотвращением радиационно-стимулированной деградации образца. Для регистрации топографического контраста с высокой чувствительностью к деталям поверхности использовался внутрилинзовый детектор вторичных электронов (InLens SE) при малом рабочем расстоянии (WD = 3,0 мм). Отсутствие эффектов накопления поверхностного заряда в выбранном режиме позволило зафиксировать истинную геометрию наночастиц без искажений.
3. Результаты и их обсуждение
Морфология ЗНЧ была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Представленные СЭМ-микрофотографии (рис. 1) демонстрируют, что ЗНЧ-Цит обладают преимущественно квазисферической морфологией. Статистический анализ полученных изображений, проведенный на основе прямых измерений массива частиц из более чем 100 индивидуальных объектов, выявил полидисперсный характер распределения. Диаметр наночастиц варьируется в диапазоне от 10 до 60 нм. Математическая обработка данных показала, что средний размер основной фракции составляет ~30 нм, что свидетельствует о формировании достаточно однородной первичной структуры.
СЭМ-изображения наночастиц золота, синтезированных с цитратом и боргидридом натрия, полученные в режиме детектирования вторичных электронов, при увеличении:
а) 50КХ; б) 200КХ
На рисунке 2 представлены изображения наночастиц, синтезированных с метотрексатом (ЗНЧ-МТХ). В результате получены крупные частицы золота преимущественно макро размера без явной определенной морфологической структуры (Рис. 2а). После добавления раствора соляной кислоты (200 мкл, 0,01 М) образовывалась пористая структура губчатого типа, сформированная в результате специфической агрегации ЗНЧ-МТХ (Рис. 2б). Представленные на рис. 2 СЭМ-изображения указывают на быстрый темп формирования большого числа зародышей наночастиц под действием боргидрида натрия как сильного восстановителя. При этом молекулы МТХ препятствуют дальнейшему росту частиц золота из-за своего размера. В результате образуется рыхлая структура, состоящая из сетчатого полимера с вкраплением наночастиц золота малого размера. На рис. 3 представлено изображение ЗНЧ-Цит-МТХ с наиболее выраженной пористой структурой.
СЭМ-изображения наночастиц золота, синтезированных в присутствии метотрексата до (рН - 7) (а) и после (рН - 2,5) (б) добавления раствора соляной кислоты, полученные при увеличении 50КХ
СЭМ-изображение наночастиц золота, синтезированных в присутствии цитрата натрия и метотрексата, полученные при увеличении 50КХ
Гистограмма распределения гидродинамического размера наночастиц золота, синтезированных в присутствии цитрата и боргидрида натрия (а), метотрексата и боргидрида натрия (б), цитрата натрия, боргидрида и метотрексата (в)
Результаты измерения гидродинамического размера наночастиц приведены на рисунке 4. В синтезе с боргидридом и цитратом натрия были получены наночастицы около 24 нм с узким распределением полидисперсности (0,18). В синтезе с МТХ наблюдаются две различные по размеру фракции: первая — 103 нм, вторая — микронного диапазона. Значение величины полидисперсности составило 0,44, что свидетельствует об умеренной неоднородности системы по размерам частиц (до 0,5). В синтезе с цитратом натрия и МТХ полидисперсность ЗНЧ составила 0,315. Сводные физико-химические характеристики образцов, включая значения рН, приведены в таблице 1.
Физико-химические характеристики золотых наночастиц, полученных в различных условиях синтеза
Образец | ЗНЧ-Цит | ЗНЧ-МТХ | ЗНЧ-Цит-МТХ |
Дзета-потенциал | -27,52 ± 0,39 мВ | -17,48 ± 0,25 мВ | -19,80 ± 0,29 мВ |
Гидродинамический размер | 24 нм | 103 нм – 1 мкм | 107 нм |
Полидисперсность | 0,18 | 0,44 | 0,315 |
рН | 2,5 | 2,5 | 3,0 |
Для идентификации специфических взаимодействий в системе был проведен сравнительный анализ спектров поглощения ЗНЧ-Цит, ЗНЧ-МТХ и ЗНЧ-Цит-МТХ. На рисунке 5 представлен спектр в видимой и ближней инфракрасной областях (диапазон длин волн от 200 до 800 нм). В спектре раствора ЗНЧ-МТХ (красная кривая) выделяются два пика на 277 нм и 558 нм. Пик на 558 нм характерен для поверхностного плазмонного резонанса золотых наночастиц. В районе 400 нм наблюдается локальный максимум низкой интенсивности. Схожий спектр поглощения у образца ЗНЧ-Цит, синтезированного без метотрексата (черная кривая) с выраженными пиками на длинах волн 299 и 528 нм (рис. 4б).
Спектр поглощения наночастиц золота, синтезированных в присутствии цитрата и боргидрида натрия (черная кривая), метотрексата (красная кривая) и в присутствии цитрата натрия и метотрексата (синяя кривая)
Спектр поглощения супернатанта наночастиц золота, синтезированных в присутствии метотрексата
На изображении видны несколько пиков: 248 нм, 277 нм, 335 нм, 523 нм. При сравнении рис. 5 и 6 обнаружены два пика, находящиеся на одной длине волны 277 нм. Также в обоих спектрах наблюдаются небольшие пики в интервале 520–560 нм. Данные максимумы свидетельствуют о поверхностном плазмонном резонансе наночастиц золота. Сдвиг пика на рис. 6 на 35 нм в коротковолновую область обусловлен образованием агрегатов наночастиц.
Далее был получен спектр поглощения тех же наночастиц после добавления раствора соляной кислоты (рис. 7).
Спектр поглощения наночастиц золота с метотрексатом после добавления раствора соляной кислоты
С целью разрушения агломератов, раствор был подкислен до значения рН равного двум.
Полученный спектр соответствует представленному на рис. 6 в области до 400 нм по длинам волн пиков. Относительная интенсивность пиков изменилась под влиянием протонирования. Кроме того, сильнокислая среда приводит к гидролизу амидной связи в молекуле МТХ. Далее золь центрифугировали и промывали деионизированной водой для удаления надосадочной жидкости вместе с продуктами гидролиза.
Пик 277 нм, присутствующий на рисунках 5-7, нехарактерен для основных пиков поглощения МТХ или ЗНЧ
, . Возникновение данной полосы обусловлено двумя факторами: межзонными переходами в золоте (5d -> 6SP) и перераспределением электронной плотности в птеридиновом кольце при хемосорбции МТХ на поверхность золота (красный сдвиг полосы 303–308 нм). С учетом изображения на СЭМ-фотографии, губчатая структура способствует многократному рассеянию света и формированию специфических электронных переходов на границе раздела фаз.
Спектр поглощения наночастиц золота с метотрексатом после добавления раствора соляной кислоты и центрифугирования
Рисунок 8 демонстрирует отсутствие различий в пиках поглощения в диапазоне от 200 до 400 нм до и после центрифугирования и диспергирования. Однако при этом обнаружен сдвиг максимума с 559 нм до 575 нм, что, характеризует процесс образования агломератов.
Спектры поглощения метотрексата в кислой (а) и щелочной (б) средах
Таким образом, возможности абсорбционной спектроскопии позволяют достоверно детектировать формирование химических связей молекул метотрексата с поверхностью наночастиц золота.
4. Заключение
В работе установлено, что метотрексат может быть использован в одноэтапном химическом синтезе наночастиц золота с целью формирования специфических губчатых наноструктур, где ЗНЧ являются центрами для связывания лекарственного препарата. Морфология полученных образцов подтверждена данными сканирующей электронной микроскопии, которая показала наличие пористой структуры за счет объединения зародышей золота в рыхлые агрегаты. Продемонстрирована эффективность абсорбционной спектроскопии для регистрации взаимодействий молекул метотрексата с поверхностью наночастиц золота. Зафиксирован сдвиг плазмонного резонанса в коротковолновую область (с 558 нм до 523 нм). Выявлены максимумы, характерные для протонированной формы метотрексата в спектре поглощения: 244 нм и 308 нм. Анализ электрокинетических свойств выявил снижение абсолютного значения дзета-потенциала с -27,52±0,39 мВ до -17,48±0,25 мВ, что указывает на уменьшение агрегативной устойчивости золя ЗНЧ-МТХ. Полученные структуры золота и метотрексата пористой морфологии обладают хорошей перспективой для дальнейшего применения как платформы для разработки средств направленной доставки метотрексата с целью повышения эффективности препарата и снижении побочных эффектов при лечении ревматоидного артрита
, .