РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ УФ-ИНДУЦИРОВАННОЙ МЕЛАНОМЫ
РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ УФ-ИНДУЦИРОВАННОЙ МЕЛАНОМЫ
Аннотация
Дермальные меланоциты и фибробласты кожи человека в модельной системе in vitro представляют собой тест-систему для изучения УФ-индуцированной генетической нестабильности и канцерогенного потенциала меланомы. Основную роль на ранней стадии опухолевой трансформации новообразований кожи, как злокачественных, так и доброкачественных (невус), играют драйверные мутации генов NRAS, BRAFV600Е и CDKN2A. Анализ воздействия УФО-С с использованием кокультуры (co-culture), в отличие от монокультур, выявил, что в условиях in vitro совместное культивирование способствует формированию сложной модели гистоморфологического соответствия пространственного и функционального подобия тканевых структур, в пределах которой обеспечиваются паракринные механизмы цитокоммуникаций подобные in vivo. Целью исследования является анализ кокультуры дермальных меланоцитов и фибробластов кожи человека в модели in vitro после УФО-С с позиции морфогенетических реактивных изменений в аспекте изучения ранних этапов онкогенеза меланомы. Культивирование клеточной линии проводили согласно рекомендациям Фрешни. УФО-С моделировали с временной экспозицией 30 и 40 сек. С дальнейшей оценкой морфологических показателей, пролиферативного потенциала, путей клеточной гибели, анализа клеточного цикла и выявления мутаций генов BRAF, NRAS и CDKN2A методом аллель-специфической real-time ПЦР (AS-qPCR) с гибридизионно-флуоресцентной детекцией.
Анализ исследуемых показателей, 3D модели УФ-индуцированной меланомы в системе in vitro на кокультурах дермальных меланоцитов и фибробластов в аспекте изучения ранних этапов онкогенеза меланомы, выявил дозозависимые изменения, такие как: снижение числа клеток и индекса пролиферации к 14-м суткам (максимально в группе CulUV2), увеличение доли клеток в S-фазе (CulUV1) и G2/M-фазе (CulUV2). В группе CulUV1 выявлено увеличение числа клеток на стадии позднего апоптоза. Значимых изменений числа клеток, погибающих по пути некроптоза не выявлено. В обоих экспериментальных группах отмечается уменьшение числа жизнеспособных клеток. А также в обеих группах (CulUV1 и CulUV2) не выявлено мутаций генов BRAF, NRAS и CDKN2A, что согласуется с литературными данными о низком накоплении мутаций в клеточной культуре.
1. Введение
Кожа — полифункциональный пограничный многотканевый орган, в процессе онтогенеза закладывается из двух эмбриональных зачатков — нейрогенного (меланоциты) и мезенхимного (фибробласты). В связи с пограничным положением испытывает воздействие различных факторов внешней среды, ключевым из которых является ультрафиолетовое облучение (УФО) , , , . Длинноволновое (УФ-А, 320–400 нм) и средневолновое (УФ-В, 280–320 нм) излучения в естественных условиях достигают поверхности Земли, постоянно воздействуют на живые организмы, на сегодняшний день уже достаточно хорошо и всесторонне изучены. В частности, известно, что УФ-А активирует пролиферацию, регенерацию, клеточный иммунитет, ускоряет гидролиз коллагена . УФ-В инициирует синтез витамина D и оказывает иммуномодулирующее и десенсибилизирующее действие , ; оба спектра являются главными факторами развития спорадической формы меланомы кожи, вызывая мутации генов супрессоров опухоли и трансформацию меланоцитов .
В отличие от УФ-А и УФ-В, коротковолновое излучение УФ-С в естественных условиях поглощается озоновым слоем. Тем не менее, массовое применение искусственных источников УФ-С (бактерицидных ламп) для стерилизации воздуха, воды и поверхностей требует тщательного изучения его мутагенности. Более того, известно, что фотоны УФ-С, как более высокоэнергетического излучения, оказывают наиболее выраженное мутагенное действие, так как этот спектр лучей совпадает со спектром поглощения нуклеиновых кислот, поэтому УФ-С служит идеальным инструментом для изучения механизмов повреждения в структуре ДНК, последующей репарации, активации УФО-индуцированного апоптоза, что критически важно для изучения механизмов онкогенеза , , , . Так, в частности, формирование CPD (циклобутановые пиримидиновые димеры Cyclobutane Pyrimidine Dimers) при воздействии УФ-С примерно в 100 раз эффективнее, чем при воздействии УФ-В, кроме этого УФ-С и УФ-В определяют оба типа повреждения в структуре ДНК (CPD и 6–4PP/pyrimidine 6-4 pyrimidone photoproducts), тогда как УФ-А только CPD , . Следовательно, УФ-С и УФ-В оба являются высокомутагенными. Хроническое облучение УФ-С индуцирует развитие устойчивой резистентности клеток меланомы к противоопухолевым препаратам .
УФО вызывает развитие меланомы как через малигнизацию невусов, так и через трансформацию меланоцитов кожи de novo , . Меланома in situ чаще локализуется на участках кожи с хронической инсоляцией — CSD (chronically sun damaged) . Основной сигнальный путь трансформации меланоцитов — MAPK, за счет активации генов RAS и RAF . NRAS является одним из наиболее часто поражаемых генов членов семейства RAS. Наиболее распространенным сайтом мутации является кодон 61 в экзоне 2 (C181A (Q61K) и A182G (Q61R)). Ген BRAF играет ключевую роль в сигнальном пути MAPK, так мутация BRAFV600Е является хорошо известной «драйвер» мутацией (40–60% случаев меланом) . Второй сигнальный путь, который активируется при меланоме — PI3K-AKT-mTOR. УФ-индуцированные мутации часто обнаруживаются в гене CDKN2A (кодирует белки-супрессоры опухолей p16 и p14ARF), первым геном с доказанным влиянием на возникновение наследственной меланомы .
Анализ влияния УФО с использованием кокультуры меланоцитов и фибробластов на генетическую нестабильность и канцерогенез меланомы в системе in vitro снимает этические и клинические ограничения, в отличие от монокультур, более физиологичен, за счет установления паракринных межклеточных взаимодействий , , . Так, фибробласты коммуницируют с меланоцитами посредством межклеточных контактов и секрецией цитокинов (SCF), белков (DKK1, sFRP, Sema7a, CCN, FAP-α) и факторов роста (KGF, HGF, bFGF, NT-3, NRG-1, TGF-β), модулируя сигнальные каскады MAPK/ERK, cAMP/PKA, Wnt/β-катенин, PI3K/Akt. Эти факторы влияют на рост, пигментацию, миграцию и адгезию меланоцитов. Также отмечено, что под воздействием УФО происходит продукция кератиноцитами цитокинов и факторов роста, которые стимулируют развитие меланомы, а комбинация MITF, SOX10 и PAX3 преобразует фибробласты мыши и человека в функциональные меланоциты . Меланоциты эпидермиса и волосяного фолликула образуют биологически разные популяции, взаимодействуя с кератиноцитами и фибробластами паракринно и контактно . Фибробласты регулируют рост и развитие меланоцитов через SCF и NRG1, включая влияние на процесс меланогенеза. Соотношение меланоцитов и кератиноцитов — 1:5, которые формируют эпидермально-меланиновую единицу.
В связи с этим целью нашей работы является анализ морфогенетических реактивных изменений в аспекте изучения ранних этапов онкогенеза меланомы на модельной системе кокультуры дермальных меланоцитов и фибробластов in vitro кожи человека после УФО.
2. Методы и принципы исследования
Для получения 3D-кокультуры клеток кожи использовали экспланты кожного лоскута (1,0×5,0 см) из области груди (ареола), взятые с информированного согласия пациента при плановой операции. Материал был получен от трех пациентов в возрасте 38-40 лет. Каждый эксперимент проводили в 8 повторностях (n=8), что обеспечило воспроизводимость полученных результатов. Ферментативную дезагрегацию ткани проводили с помощью трипсина по стандартному протоколу . Для культивировали использована питательная среда, состоящая из RPMI-1640, 10% сыворотки эмбрионов телят и 100 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия). Инкубировали при 5% СО2 и +37°С (СО2-инкубатор CB-53, BINDER GmbH, Германия). Смену среды проводили каждые 3 суток. Полноценный монослой в первичной культуре формировался на 20–30-е сутки. Для субкультивирования клетки переводили в суспензию трипсин-ЭДТА (ПанЭко, Россия) по методике Фрешни и расселяли в концентрации 200 тыс./мл.
Культивирование кокультуры проводили путем посева на носитель/систему «Transwell» (Corning, США) — пористые мембранные вставки из тетрафторэтилена (ПТФЭ) с коллагеновым покрытием, которые используют для совместного культивирования нескольких клеточных линий в трехмерном пространстве- 3D (подобие in vivo). Размер пор варьируется от 0,4 до 8 мкм, толщина составляет 10–30 мкм, а пористость — 10–15% .
Идентификацию/подтверждение принадлежности клеток к меланоцитарной линии дифференцировки и к линии клеток фибробластического дифферона проводили с использованием кластеров дифференцировки (CD) в культуре (иммунофенотипирование) методом проточной цитофлуорииметрии на проточном цитофлуориметрие CyFlowSpace (Partec, Германия) с лазером 488 нм и фильтром 650 нм. , . Так, в частности, для подтверждения клеток меланоцитарной линии эпидермальных меланоцитов использовали СD117 (c-Kit, рецепторная тирозинкиназа) , , , . Идентификацию клеточной популяции фибробластов проводили с использованием CD90 (Thy-1, гликопротеин клеточной поверхности) , .
Анализ программированной клеточной гибели (апоптоз, некроптоз) и клеточного цикла проводили на проточном цитофлуориметрие CyFlowSpace (Partec, Германия), лазер 488 нм и фильтр 650 нм. Клетки снимали с Трипсин-ЭДТА, отмывали PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин). Суспензию фильтровали через 100 мкм нейлоновый фильтр. Работу проводили с использованием набора Annexin V PE/7AAD (BD Bioscientices, США) согласно инструкции производителя: Аннексин V-/7AAD- — интактные клетки, Аннекснин V+/7AAD- — ранний апоптоз, Аннекснин V+/7AAD+ — поздний апоптоз, Аннекснин V-/7AAD+ — некроптоз. Для анализа клеточного цикла клетки фиксировали в 70% этаноле, окрашивали пропидий йодидом, оценивали фазы G0/G1, S и G2/M.
В процессе работы с помощью гейтирования выделялись клетки в определённом диапазоне (по SSC/FSC) для исключения клеточного дебриса. Алгоритм гейтирования: дискриминация дуплетов (Singlets) за счет построения графика соотношения площади сигнала (FSC-A) к высоте (FSC-H). Клетки, идущие поодиночке, образуют прямую диагональ вокруг которой создают первый гейт. Далее исключают слипшиеся клетки, дебрис и мертвых клеток используя параметры прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Дебрис имеет очень низкий FSC. Для точной отсечки мертвых клеток используют витальные красители (в частности, 7-AAD), задав гейт на негативную по флуоресценции популяцию, далее выделяли специфические популяции. Гейтируемые регионы устанавливали на точечных диаграммах распределения событий в координатах 100 FSC/SSC. Полученные гистограммы и точечные графики (дот-плоты) анализировали с оценкой абсолютного числа, процентного соотношения популяций и выявления аномальных (аберрантных) клеток.
Исследования 3D модели УФ-индуцированной меланомы в системе in vitro проводили на кокультурах 3-го пассажа (8-й день). Перед облучением ростовую среду заменяли на DPBS, после облучения — на свежую питательную среду. Источник УФО-С — ртутная лампа низкого давления (36 Вт, Thermo Scientific, США) с максимумом излучения в УФ (253,7 нм). УФО проводили 30 и 40 секунд (экспозиции подобраны ранее); мощность составила 20 Дж/см2. Сформированы 3 группы кокультур:
- Cul — контроль (без облучения);
- CulUV1 — облучение 30 секунд;
- CulUV2 — облучение 40 секунд (рис. 1).
Дизайн эксперимента
Подсчет количества жизнеспособных и погибших клеток проводили на автоматическом счетчике TC-20 (BIO-RAD, США) с окраской трипановым синим (3 повтора на пробу). Индекс пролиферации (ИП) = численность клеток после культивирования / исходная численность. Пролиферативный потенциал оценивали по динамике жизнеспособных клеток.
Флуоресцентная микроскопия – прижизненное окрашивание Hoechst 33258 (Sigma, США; возбуждение 352 нм, эмиссия 461 нм) на микроскопе Axio Vert. A1 FL.
Выявление мутаций BRAF, NRAS и CDKN2A проводили методом аллель-специфической real-time ПЦР (AS-qPCR) с гибридизионно-флуоресцентной детекцией на амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США). In silico дизайн высокоспецифичных конструкций олигонуклеотидных праймеров (табл. 1) к точкам мутаций анализируемых генов проводили с использованием программного обеспечения Unipro UGENE v1.29.0 и Mega 10 — Molecular Evolutionary Genetics Analysis (http://www.megasoftware.net), BLAST — Basic Local Alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Использованные в работе олигонуклеотидные праймеры
Ген | Мутация | Праймеры | Длина продукта, п.н. |
BRAF | p.V600E (c.1799T>A) | F.: ctagtaactcagcagcatctcagg R.: gaaagcatctcacctcactcaacac | 434 |
NRAS | p.Q61H (c.183R>Y) p.Q61R (c.182A>G) p.Q61L (c.182A>T) p.Q61K (c.181C>A) | F.: aagctctatcttccctagtgtgg R.: gacaaaccagataggcagaaatgg | 409 |
CDKN2A | p.P114L (c.341C>T) p.W110* (c.330G>A) p.W110* (c.329G>A) p.R80* (c.238C>T) p.R58* (c.172C>T) | F.: tgctggaaaatgaatgctctgagc R.: atgtaggggtacttagcacactgg | 403 |
p.Q50* (c.148C>T) | F.: ctcatctctcttcttggcttcc R.: agcaccggaggaagaaagaggag | 466 |
Статистическую обработку проводили в программах Excel 2010 и Prism 8.0.1 (Graphpad, США). Нормальность распределения проверяли критерием Шапиро–Уилка. Для каждой выборки рассчитывали среднее и стандартное отклонение. Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента; критический уровень значимости p<0,05.
3. Основные результаты и обсуждение
Кокультура дермальных меланоцитов и фибробластов 3-го пассажа представлена клетками кожи двух дифферонов с разной степенью дифференцировки. Прикрепленные клетки веретеновидной удлиненной (активные фибробласты) или распластанной звездчатой с отростками (меланоциты) формы (рис. 2), с четким контуром и плотным ядром. Фибробласты веретеновидные, с отростками первого и второго порядка, ориентированы параллельно или волнообразно вокруг центра колонии. В слабо базофильной цитоплазме выделяются эндоплазма (нитевидные структуры, гранулы) и эктоплазма (микрофибриллы). Ядро овальное, базофильное, с 2–4 ядрышками, что указывает на метаболическую активность фибробластов (рис. 2В). Меланоциты полигональной, трехгранной или звездчатой формы с 3-5 отростками и плотным ядром (рис. 2Д).
За первые 7 дней культивирования (до УФО) прирост клеточной массы был синхронным. Индекс пролиферации (ИП) составил в группах Cul, CulUV1 и CulUV2 — 3,07; 3,25 и 2,89, соответственно; пролиферативный потенциал (ПП) — 94%, 91% и 90%, соответственно. Межгрупповых статистически значимых различий по общему количеству клеток (ОКК) и количеству жизнеспособных клеток (КЖК) не выявлено.
Кокультура фибробластов и дермальных меланоцитов. Световая микроскопия (витальная культура): А – 7 сутки культивирования. Окраска ГЭ: Б – 7 сутки культивирования, В – 8 сутки культивирования, Г, Д – 16 сутки культивирования
стрелки черного цвета – меланоциты, синего цвета – фибробласты. 1 – звездчатая форма; 2 – полигональная форма; 3 – трехгранная форма
Кокультура CulUV2 (УФО 40 с): через 24 часа после УФО изменения со стороны морфологии клеток в данной группе более выраженные: грубозернистая цитоплазма, истончение отростков вплоть до полной редукции (рис. 3Б). Отмечается мозаичность реактивных изменений: присутствуют как интактные клетки, так и клетки с УФО-индуцируемым некроптозом. Согласно концепции неклеточной автономной регуляции, фенотипы могут определяться связью «лиганд-рецептор» между соседними клетками. Это имеет место в некоторых формах клеточной конкуренции, где клетки чувствуют более низкую приспособленность своих соседей через взаимодействия Slit-Robo, Spaetzle-Toll или Sas-PTP10D, но и зависят от прямого контакта с неповрежденными соседними клетками , , . Поврежденные клетки способствуют прогрессированию апоптоза и удалению сильно поврежденных клеток, одновременно снижая их транскрипционный ответ на УФО, включая реакцию на окислительный стресс и другие механизмы. Такая регуляция на уровне популяции может представлять собой общий механизм, посредством которого клеточные сообщества способствуют удалению сильно поврежденных клеток .
В группах CulUV1 и CulUV2 показатели ОКК и КЖК статистически не различаются (p>0,05). ИП увеличен по сравнению с контролем (1,28): в CulUV1 — 1,35, в CulUV2 — 1,42. ПП снижается относительно контроля (94%): в CulUV1 — 83%, в CulUV2 — 70%, как показатель дозозависимого снижения числа жизнеспособных клеток.
Кокультура фибробластов и дермальных меланоцитов: А –CulUV1, Б – CulUV2
увеличение ок. 10 х об. 20
На фоне дозозависимого снижения ОКК отмечено изменение показателей клеточного цикла (рис. 4). Так, на стадии G0/G1: контроль — 88,1%, CulUV1 — 83,8, CulUV2 — 80,4%. На S-стадии: контроль — 4,4%, CulUV1 — 8,5%, CulUV2 — 4,7%. На стадии G2/M: в CulUV2 (14,9%) — в два раза выше, чем в контроле (7,5%) и CulUV1 (7,7%). Это отражает активацию чек-пойнт системы контроля клеточного цикла на границе G2 и М-стадии клеточного цикла и УФ-индуцируемого апоптоза .
Проточная цитофлуориметрия. Клеточный цикл кокультуры дермальных меланоцитов и фибробластов в группах Cul (А), CulUV1 (Б) и CulUV2 (В). Окраска PI
УФО — индуктор апоптоза в культивируемых клетках, является адекватной реакцией на повреждение УФО, обусловленной как уже отмечалось выше повреждением ДНК и ядра и митохондрий, нарушением механизмов репарации ДНК (в первую очередь фотореактивация, эксцизионная и пострепликативная), дисфункцией митохондрий, АФК и активацией каспаз на фоне гипоксии , , . Так, в частности, УФО приводит к нарушению функции митохондрий, главным образом, за счет повреждения мтДНК и, как следствие, определяет чрезмерное образование АФК, что приводит к усилению окислительного стресса в клетках, вызывает нарушение мембранного потенциала митохондрий и баланс ионов кальция. В свою очередь, избыток АФК приводит к окислению липидов и белков митохондрий с нарушением энергетического метаболизма , , . Морфологические признаки апоптоза определяются активностью эфекторных каспаз 3 и 7, которые определяют фрагментацию ДНК, апоптозные изменения и потерю жизнеспособности клетки, являясь ключевым медиатором нарушения митохондриального потенциала и высвобождения AIF . Следствием этого является коллапс ядра: сначала пикноз (за счет активации трансглютаминазы), затем поэтапная упорядоченная фрагментация ДНК . Нарушается асимметрия фосфолипидов мембраны (экспозиция фосфатидилсерина и других продуктов), что способствует фагоцитозу апоптических клеток макрофагами. Финальная фаза — образование «апоптотических телец» — блеббинг.
Проточная цитофлуориметрия. Кокультура фибробластов и дермальных меланоцитов. Реализация ПКГ в группе Cul (А) и через 24 часа после облучения в течение 30 сек – группа CulUV1 (Б). Окраска 7AAD, Аннексин V
Q1 – ранний апоптоз, Q2 – поздний апоптоз, Q3 – интактные клетки, Q4 – некроптоз
В группах CulUV1 и CulUV2 мутаций генов BRAF, NRAS и CDKN2A не выявлено, что согласуется с литературными данными о низком накоплении мутаций в культуре .
4. Заключение
Таким образом, проведенные исследования 3D модели УФ-индуцированной меланомы в системе in vitro на кокультурах дермальных меланоцитов и фибробластах позволили выявить дозозависимые изменения: снижение числа клеток и индекса пролиферации к 14-м суткам (максимально в группе CulUV2), увеличение доли клеток в S-фазе (CulUV1) и G2/M-фазе (CulUV2). В группе CulUV1 выявлено увеличение числа клеток на стадии позднего апоптоза. Значимых изменений числа клеток, погибающих по пути некроптоза не выявлено. В обеих экспериментальных группах отмечается уменьшение числа жизнеспособных клеток. А также в обеих группах (CulUV1) и (CulUV2) не выявлено мутаций генов BRAF, NRAS и CDKN2A, что согласуется с литературными данными о низком накоплении мутаций в клеточной культуре.