ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ВТОРОЙ ФАЗЫ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ

Лабыгина А.В.¹, Ступко Е.Е.²,   Вяткина И.С.³, Сутурина Л.В.⁴, Колесникова Л.И.⁵

¹Доктор медицинских наук, ²Аспирант, ³Аспирант, ⁴Доктор медицинских наук, профессор ⁵Доктор медицинских наук, Член-корреспондент РАМН, ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения РАМН, Иркутск

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ВТОРОЙ ФАЗЫ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ

Аннотация

В статье рассмотрены особенности метаболизма, а именно: процессы перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и биоэлементный статус,- у инфертильных женщин, проживающих в Восточной Сибири, носительниц различных вариантов гаплотипов генов второй фазы детоксикации ксенобиотиков (GSTP1, GSTT1 и GSTM1). Показано, что метаболизм женщин с бесплодием характеризуется дисбалансом в системе перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита, с выраженным дефицитом антиоксидантов. А также установлены некоторые метаболические особенности в зависимости от варианта носительства генов детоксикации.

Ключевые слова: метаболизм, биоэлементы,  гены детоксикации, бесплодие.

Labygina A.V.¹, Stupko E.E.², Vyatkina I.S.³, Suturina L.V.⁴, Kolesnikova L.I.⁵

¹ MD , Ph.D.; ² Postgraduate stuent; ³Ph.D. Postgraduate stuent; ⁴ MD, Ph.D., professor; ⁵ MD, Corresponding Member of the Academy of Medical Sciences, Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction SB RAMS, Irkutsk

FEATURES OF METABOLISM AND POLYMORPHISM OF XENOBIOTIC DETOXIFICATION GENES (PHASE II) IN WOMEN WITH INFERTILITY

Abstract:

The article describes the features of metabolism, namely lipid peroxidation, antioxidant protection and bioelementny status - in infertile women living in Eastern Siberia, the carriers of different variants of gene haplotypes of the second phase of detoxification of xenobiotics (GSTP1, GSTT1 and GSTM1). It is shown that the metabolism in women with infertility is characterized by an imbalance in the lipid peroxidation - antioxidant protection, with a marked deficiency of antioxidants. And also installed some metabolic features depending on the variant gene carriers detoxification.

Keywords: metabolism, bioelements, detoxification genes, sterility.

Глутатион опосредованная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к перекисному окислению липидов, свободным радикалам, алкилированию белков и предотвращению поломок ДНК. Помимо этого, глутатионтрансферазам (GST) принадлежит важная роль внутриклеточных переносчиков различных форм билирубина, гормонов, а также в биосинтезе некоторых физиологически активных веществ – простагландинов. GST присутствуют в самых разных тканях, обнаруживая выраженные межтканевые различия в отношении их различных  классов. Особенно высока их концентрация в печени, плаценте, легких, мозге, кишечнике, почках [3]. GST катализируют взаимодействие глютамата с электрофильными атомами азота, углерода, серы, кислорода и отвечают за конъюгацию сульфгидрильной группы с молекулами ксенобиотиков. Полиморфизм GST определяет индивидуальную чувствительность организма к воздействию факторов внешней среды [15]. Известно, что функционально неполноценные аллели генов, кодирующих ферменты второй фазы  детоксикации ксенобиотиков, играют важную роль в патогенезе целого ряда заболеваний, таких как: эндометриоз, рак яичников, внутриэпителиальная неоплазия, лейомиома [1]. Показан существенный вклад полиморфизмов генов детоксикации ксенобиотиков в предрасположенность к развитию целого ряда заболеваний [4,12,20,22,27,28].  Это происходит за счет того, что индивидуумы, имеющие функционально неполноценные аллели  генов биотрансформации ксенобиотиков могут оказаться более чувствительными к действию повреждающих факторов [24].

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является неотъемлемым звеном липидного метаболизма. Этот процесс рассматривается как неспецифическая реакция метаболизма на факторы экзогенной и эндогенной природы и происходит в клетках всех тканей и органов [5]. Предотвращение избыточной активации ПОЛ осуществляется благодаря наличию специальной системы антиоксидантной защиты (АОЗ), основу которой составляет комплекс веществ ферментативной и неферментативной природы [13,14]. Реакции пероксидации являются необходимым этапом различных метаболических процессов, а чрезмерная активация пероксидации во многих случаях является либо следствием, либо причиной тех или иных патологических изменений в организме [9].

Важнейшими компонентами метаболических процессов, контролирующих практически все ферментативные реакции организма человека, являются биоэлементы (макро – и микроэлементы). Биоэлементы принимают участие в процессах  свертывании крови, в изменении проницаемости мембран по отношению к ионам калия, натрия, кальция, запуске внутриклеточных процессов, таких как рост, развитие, сокращение органелл, деление, секреция и др. [2] Таким образом, биоэлементы принимают активное участие в поддержании гомеостаза, выступая в роли интеграторов метаболизма и многообразных клеточных функций  [2].

Известно, что содержание и распределение биоэлементов в различных тканях и органах меняются при различных патологических состояниях [16]. Так, результаты исследования биоэлементов у инфертильных женщин, проживающих в Восточной Сибири,  установили снижение в сыворотке крови концентрации цинка, меди, кальция и магния по сравнению с аналогичными показателями фертильных женщин [5-9].

 Целью нашего исследования явилось изучение особенностей метаболизма, в частности процессов перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и биоэлементного статуса, у инфертильных женщин – европеоидов, проживающих в Восточной Сибири, носительниц различных вариантов гаплотипов генов второй фазы детоксикации ксенобиотиков (GSTP1, GSTT1 и GSTM1).

Материалы и методы

Исследование проводилось в ФГБУ НЦ ПЗСРЧ СО РАМН в 2006-2010 гг. Были изучены гормонально-метаболические показатели и частоты  аллелей генов GSTT1 и GSTM1 у 116 женщин – европеоидов репродуктивного возраста (30,6±4,36 лет): 85 женщин с бесплодием (основная группа),  31 фертильные женщины (контрольная группа). Длительность бесплодия в группе исследования была от 1 до 18 лет (5,36±3,4 лет). Клиническая характеристика женщин исследуемых групп  представлена в табл.1.

Таблица 1. Клиническая характеристика женщин исследуемых групп

группы исследования	женщины с бесплодием N=85		контрольная группа N=31
признаки	N	%	N	%
бесплодие первичное	N=50	58,8%	0
бесплодие вторичное	N=35	41,2%	0
ановуляция	N=40	47%	0
недостаточность лютеиновой фазы	N=29	34%	0
гиперпролактинемия	N=50	59%	4	13%
СПКЯ	N=22	26%	0
эндометриоз	N=45	52%	0
невынашивание	N=14	16,5 %	0
миома	N=17	20%	1	3%
аменорея	N=2	1%	0
ожирение	N=5	6%	0
мастопатия	N=20	23,5%	3	10%
гипоталамическая дисфункция	N=13	15,5%	3	10%

При изучении процессов пероксидации липидов (ПОЛ) исследовали  концентрации в сыворотке крови субстратов с сопряженными двойными связями и продуктов ПОЛ, образующихся на различных этапах цепной свободнорадикальной реакции (ДК, КД-СТ, МДА). Об активности системы антиоксидантной защиты судили по общей АОА сыворотки крови и содержанию основных низкомолекулярных компонентов (α-токоферола, ретинола, аскорбата, GSH, GSSG). Ферментативное звено АОЗ оценивали по активности ключевого антиоксиданта – СОД.

Для выявления делеционного полиморфизма в генах GSTT1 и GSTM1 использовался метод полимеразной цепной реакции с использованием наборов реактивов фирмы ФГУП «ГосНИИ генетика» (Москва)  в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия).

В работе с больными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000).

В исследовании использовались вычислительные  методы математической статистики, реализованные в лицензионном интегрированном статистическом пакете комплексной обработки данных STATISTICA 6.1 Stat-Soft Inc, США.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате генетического исследования в группе женщин с бесплодием (N=85) установлено 4 варианта носительства гаплотипов генов  GSTM1 и GSTT1 (табл.2):

1 группа (М/Т) – 35 женщин с носительством аллелей GSTM1+/ GSTT1+

2 группа (М/0) – 11 женщин с носительством аллелей GSTM1+/ GSTT1- 0

3 группа (0/Т) – 30 женщин с носительством аллелей GSTM1-0/ GSTT1+

4 группа (0/0) – 9 женщин с  носительством аллелей GSTM1-0/ GSTT1-0

У пациенток  с бесплодием  в 1,5 раза чаще в сравнении с группой фертильных женщин выявлено наличие нулевых  гаплотипов генов GSTT1-0 / GSTM1-0 (ОR = 1,7; χ2 = 0,45; Р(χ2) = 0,26). Носительство гаплотипов GSTM1+/ GSTT1-0 было несколько выше  у женщин  из контрольной группы по сравнению с женщинами с эндокринным бесплодием (22,5% против 11,8%; χ2 = 2,12;  Р(χ²) = 0,07; ОR=0,46; CI 95 %: 0,162 – 1,31) [табл. 2.].

Таблица 2. Распределение гаплотипов  GSTM1 и GSTT1 у женщин с бесплодием и контрольной группе

группы	женщины с бесплодием N=85		контрольная группа   N=31		ОШ	Р(χ2)
гаплотипы	N	%	N	%
GSTM1+/ GSTT1+	36	42,3%	11	35,5%	1,33	P=0,2806
GSTM1+/ GSTT1-0	10	11,8%	7	22,5%	0,46	P=0,0721
GSTM1-0/ GSTT1+	30	35,3%	11	35,5%	0,99	P=0,4604
GSTM1-0/ GSTT1-0	9	10,6%	2	6,5%	1,7	P=0,2626

В дальнейшем мы проводили изучение метаболических параметров в группах женщин с бесплодием в зависимости от носительства гаплотипов GSTT1 и GSTM1.

При изучении процессов пероксидации липидов и антиоксидантной защиты было отмечено повышение диеновых коньюгатов (ДК)  у 9%, повышение концентраций  ТБК-АП - у 15,3 % женщин с бесплодием и у 13% женщин контрольной группы, а снижение ТБК-АП у 77% женщин с бесплодием и 70% женщин контрольной группы. Антиоксидантная система характеризовалась снижением уровня ретинола  у 20 %, α-токоферола у 43 %, супероксиддисмутазы у 31%, GSSG у 15,5%   женщин с бесплодием. При этом уровень общей антиокислительной активности крови (АОА)  был ниже референтных значений у 32% женщин с бесплодием и у 53% женщин из контрольной группы.

Было выявлено снижение содержания биоэлементов крови: Zn -  у 8,5 % женщин с бесплодием и у 3% женщин из контрольной группы, Mg - у 7,1 % женщин с бесплодием и у 1,5 % женщин из контрольной группы,   Cu -  у 14,8 % женщин с бесплодием и у 3,0 % женщин из контрольной группы. При рассмотрении молекулярных антиоксидантов выявлено, что у всех бесплодных женщин наблюдается пониженное содержание в крови ретинола и α-токоферола. Повышенный расход молекулярных антиоксидантов у бесплодных женщин определяется их участием в ингибировании процессов липопероксидации.

При рассмотрении метаболических особенностей в зависимости от варианта носительства генов детоксикации было установлено, что женщины с носительством генотипа GSTM1+/GSTT1+ отличались от женщин с  носительством GSTM1-0/GSTT1+ уменьшением концентраций ретинола, субстратов пероксидации липидов с сопряженными Дв.св. и ДК [табл. 3.], от женщин с носительством  GSTM1-0/GSTT1- 0  отличались уменьшением содержания  ретинола и повышением концентраций магния [табл. 4.].

Женщины с носительством генотипа GSTM1+/GSTT1-0 отличались от женщин с  носительством GSTM1-0/GSTT1-0 повышением концентраций магния и цинка [табл. 5.].

Таблица 3. Наиболее значимые различия у женщин с бесплодием  и носительством генотипов  GSTM1+/GSTT1+(1)  и  GSTM1-0/GSTT1+(3)

Исследуемые группы	Группа 1 GSTM1+/ GSTT1+              N=36	Группа 3 GSTM1-0/ GSTT1+ N=30	Уровень значимости P < 0,05
показатель	N; М ± σ; Me; (25-й и 75-й процентиль)		U, W-W, K-S
Ретинол мкмоль/л	0,62 ± 0,26 0,56 (0,44 и 0,68)	0,80 ± 0,18 0,76 (0,51 и 0,85)	P1 – 3=0,045*
Дв.связи отн. ед	2,22 ± 0,67 2,00 (1,82 и 2,82)	2,85 ± 1,21 2,31 (1,95 и 3,81)	P1 – 3=0,006**
ДК нмоль/г липидов	1,42 ± 0,49 1,30 (1,08 и 1,68)	1,79 ± 0,33 1,71 (1,18 и 2,46)	P1 – 3=0,07*

Таблица 4. Наиболее значимые различия у женщин с бесплодием  и носительством генотипов  GSTM1+/GSTT1+(1)  и  GSTM1-0/GSTT1-0(4)

Исследуемые группы	Группа 1 GSTM1+/ GSTT1+              N=36	Группа 4 GSTM1-0/ GSTT1-0 N=9	Уровень значимости P < 0,05
показатель	М ± σ; Me; (25-й и 75-й процентиль)		U, W-W, K-S
Магний	0,91 ± 0,11 0,88 (0,84 и 0,97)	0,75 ± 0,05 0,76 (0,71 и 0,79)	P1 – 4=0,04*
Ретинол мкмоль/л	0,62 ± 0,26 0,56 (0,44 и 0,68)	0,84 ± 0,26 0,89 (0,65 и 1,04)	P1 – 4=0,046*

Таблица 5. Наиболее значимые различия у женщин с бесплодием  и носительством аллелей GSTM1+/GSTT1-0 (2) и  GSTM1-0/GSTT1-0(4)

Исследуемые группы	Группа 2 GSTM1+/GSTT1-0 N=10	Группа 4 GSTM1-0/ GSTT1-0 N=9	Уровень значимости P < 0,05
показатель	М ± σ; Me; (25-й и 75-й процентиль)		U,  W-W,  K-S
Магний	0,93 ± 0,04 0,93 (0,89 и 0,96)	0,75 ± 0,05 0,76 (0,71 и 0,79)	P2 – 4=0,00009**
Цинк	18,66 ± 2,04 18,60 (13,95 и 22,92)	9,55 ± 3,05 8,85 (7,26 и 11,84)	P2 – 4=0,02*

Для табл. 3-5: P (1 – 2)* при уровне значимости не менее 2 из 3 критериев (Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test)); P (1 – 2)** при уровне значимости не менее 2 из 3 критериев(Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test)) с поправкой Бонферрони при множественных сравнениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, особенности метаболизма женщин с бесплодием характеризуются дисбалансом в системе перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита, с выраженным дефицитом антиоксидантов. Так, снижение уровня ретинола установлено  у 20 %, α-токоферола у 43 %, супероксиддисмутазы у 31%, GSSG у 15,5%   женщин с бесплодием. Отмечено снижение содержания биоэлементов в сыворотке крови: Zn, Mg, Cu у 7,1 % - 14,8 % женщин с бесплодием, что в 3-5 раз превышает данный показатель у фертильных женщин ( р (χ²) < 0,05).

В нашем исследовании было установлены  некоторые метаболические особенности в зависимости от варианта носительства генов детоксикации. Так при носительстве «мутантного генотипа» GSTM1-0/GSTT1-0  отмечалось снижение уровня магния при повышении концентрации ретинола по сравнению с носительницами гомозиготного генотипа GSTM1+/GSTT1+. Женщины с носительством генотипа GSTM1+/GSTT1+ отличались от женщин с  носительством GSTM1-0/GSTT1+ уменьшением концентраций ретинола, субстратов пероксидации липидов с сопряженными Дв.св. и ДК.

Женщины с носительством генотипа GSTM1+/GSTT1-0 отличались от женщин с  носительством GSTM1-0/GSTT1-0 повышением концентраций магния и цинка, что можно расценивать, как самый «благоприятный тип», который встречался значимо чаще у фертильных женщин.