ВЛИЯНИЕ ЭТИЛОВОГО СПИРТА НА ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ЛИПИДНЫМ КОМПЛЕКСОМ ИЗ ТУНИКИ МОРСКОГО ГИДРОБИОНТА HALOCINTHIA AURANTIUM
ВЛИЯНИЕ ЭТИЛОВОГО СПИРТА НА ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ЛИПИДНЫМ КОМПЛЕКСОМ ИЗ ТУНИКИ МОРСКОГО ГИДРОБИОНТА HALOCINTHIA AURANTIUM
Аннотация
Введение липидного комплекса, выделенного из туники асцидии пурпурной (Halocinthia aurantium) после интоксикации этиловым спиртом способствовало восстановлению липидного состава мембран эритроцитов, показателей осмотической резистентности и размерных характеристик эритроцитов крыс за счет входящих в его состав природных фосфолипидов и жирных кислот, что и определяет мембранозащитный эффект препарата.
Цель работы: изучить влияние липидного комплекса, выделенного из туники асцидии пурпурной на липидный состав мембран эритроцитов крыс в условиях интоксикации этиловым спиртом.
Проведен эксперимент на белых крысах-самцах линии Вистар, содержащихся в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс в каждой: 1-я – контроль (интактные); 2-я – введение 33% этилового спирта в течение 7 дней; 3-я – введение 33% этилового спирта в течение 7 дней с последующей отменой в течение 7 дней; 4-я – введение липидного комплекса асцидии в течение 7 дней после 7-дневной интоксикации этиловым спиртом. Этанол (33%) вводили в дозе 7,5 мл/кг два раза в сутки, а липидный комплекс асцидии в дозе 0,2 мл/100 г массы.
Интоксикация этиловым спиртом сопровождалась нарушением липидного состава эритроцитарных мембран: увеличились значения холестерина, сфингомиелина, лизофракций фосфолипидов. Увеличивались размерные характеристики эритроцитов и снижалась их осмотическая резистентность. В период отмены этанола в течение 7 дней сохранялся макроцитоз, не наблюдалось полного восстановления липидной составляющей мембран эритроцитов. Введение липидного комплекса асцидии в период после отмены этанола способствовало восстановлению липидного спектра мембран эритроцитов, а также нормализовало физиологические характеристики эритроцитов крыс.
Полученные результаты свидетельствуют о нарушении структурной организации мембран эритроцитов при интоксикации этиловым спиртом, что требует необходимость профилактической фармакокоррекции. Применение липидных комплексов, содержащих «морские» липиды, выделенные из морских гидробионтов, в частности из туники асцидии пурпурной, может быть полезным и перспективным в комплексной реабилитации больных алкоголизмом.
1. Введение
Изначальной мишенью воздействия этанола на организм является липидный слой клеточной мембраны клетки . Токсическое воздействие этилового спирта, обуславливается его мембрано-разжижающим эффектом, растворяясь в биологических средах он вызывает структурные изменения фосфолипидного бислоя и, как следствие, частично блокирует трансмембранный перенос ионов . Длительный прием приводит к изменениям в структуре мембран клеток, увеличению содержания холестерина и возникновению ригидности клеточных стенок . Все эти процессы приводят к интенсификации перекисного окисления липидов, активации эндогенных фосфолипаз и протеаз, уменьшению активности системы антиоксидантной защиты клетки .
Наиболее уязвимыми считаются мембраны эритроцитов, поскольку в их составе большое количество легко окисляемых фосфолипидов. Нарушение баланса соотношения липидных составляющих мембран изменяет физические параметры эритроцитов, увеличивает их размерные характеристики .
Перспективными средствами для восстановления нарушенных мембранных структур при алкогольном поражении организма являются природные биологически активные вещества, полученные из сырья как наземного, так и морского происхождения. Морские гидробионты являются богатыми источниками различных витаминов, аминокислот, гликолипидов, нейтральных и фосфолипидов, микро- и макроэлементов, полифенолов, полисахаридов. Также в их составе присутствуют n-3 и n-6 семейства полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Известно, что ПНЖК омега-3 помимо гиполипидемического эффекта оказывают антиагрегантное, гипокоагуляционное, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие .
Одним из представителей морских гидробионтов является асцидия пурпурная (Halocinthia aurantium), обитающая в прибрежной зоне залива Петра Великого Японского моря. По зоологической систематике асцидия относится к типу хордовых (Chordata), подтипу оболочников (Tunicata), классу асцидий (Ascidiae), отряду складчатожаберных асцидий (Stolidobranchiata), семейству пиуридов (Pyuridae). Эта форма асцидий широко распространена в дальневосточных и арктических морях на глубинах от 4 до 400 метров . В ее тунике сконцентрировано значительное количество биологически активных веществ липидной природы. Это обусловило необходимость выделить липидный комплекс из туники асцидии и исследовать его биологический эффект. Химический анализ показал, биологически значимое содержание фосфолипидов, нейтральных липидов, полиненасыщенных жирных кислот семейства n-3 и n-6, способствующих репарации мембранных структур . Подробный химический состав липидного комплекса асцидии представлен в наших ранее опубликованных работах . Кроме того, данный комплекс показал высокую эффективность в экспериментах на лабораторных животных при лучевом поражении , дислипидемиях , как липидкоррегирующее средство при гиперхолестериновом рационе с высокожировой нагрузкой, при изучении интоксикационного действия четыреххлористого углерода и последующей его коррекции .
Целью исследования явилось изучение влияния приема липидного комплекса, извлеченного из туники асцидии пурпурной на липидный слой мембран эритроцитов крыс в условиях хронической интоксикации этанолом.
2. Методы и принципы исследования
Сбор образцов асцидии пурпурной (Halocynthia aurantium) осуществлялся в летний период в районе б. Западная, о-в Попова, зал. Петра Великого (Японское море). Далее их тщательно сортировали и очищали от частиц песка и эпифитов, тунику отделяли от внутренностей и подошвы, промывали морской и водопроводной водой, затем высушивали при температуре, не превышающей 500С. Выборка особей составляла 20 единиц. Высушенную тунику измельчали в порошкообразное состояние и в соответствии с общепринятым методом для выделения липидов из растительного и животного сырья, экстрагировали смесью хлороформ:метанол (1:2 по объему) . К экстракту добавляли раствор хлористого натрия (0,73%) в количестве 20% от объема, для получения липидной фракции. Полученный при разделении фаз хлороформный липидосодержащий слой, разделяли на делительной воронке и на роторном испарителе упаривали до отсутствия запаха хлороформа. Липидный комплекс смешивали с вазелиновым маслом из расчета 80 мг/кг массы животного . Вазелиновое масло считается химически инертной средой и не оказывает непосредственного влияния на результаты эксперимента .
Был проведен эксперимент на животных, белых крысах-самцах с массой тела 200 г, при стандартных условиях содержания в виварии. До начала эксперимента выполнена адаптация животных в течение 7 суток. После адаптации крыс распределяли на интактных (контроль), потреблявших стандартный рацион, и крыс, подвергавшихся моделированию алкогольной интоксикации. В течение 7 дней им вводили 33% этанол в дозе 7,5 мл/кг два раза в сутки. Использована схема эксперимента, разработанная A. Gajdos . Далее животным через желудочный зонд вводили липидный комплекс асцидии с дозировкой 0,2 мл/100 г массы тела ежедневно, в течение 7 дней. Группы «стресс» и «контроль» получали вазелиновое масло в эквиобъемном количестве. Выделены 4 группы животных по 10 крыс в каждой: 1-я – контроль; 2-я – интоксикация этанолом в течение 7 дней; 3-я – интоксикация этанолом в течение 7 дней с последующей отменой в течение 7 дней; 4-я – введение липидного комплекса асцидии в течение 7 дней после 7-дневной интоксикации этиловым спиртом. Из эксперимента животных выводили путем декапитации под легким эфирным наркозом в строгом соответствии с международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Эксперимент получил одобрение комиссии по вопросам этики в Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН (протокол № 15 от 29 октября 2021 г.).
Разделение крови на фракции осуществлялось методом центрифугирования . Для выделения мембранной массы, эритроциты гемолизировали в дистиллированной воде. Экстракты общих липидов выделенные из мембран эритроцитов готовили по методу J. Folch et al. . Разделение фосфолипидных фракций осуществлялось методом двумерной микротонкослойной хроматографии. Разделяющей системой служили смеси растворителей, описанные G. Rouser и соавт. . Идентификацию фосфолипидных фракций на хроматограммах проводили по методу V.E. Vaskovsky и соавт. . Хроматографическое распределение нейтральных липидов для количественной характеристики уровня холестерина проводили методом одномерной микротонкослойной хроматографии в системе растворителей, описанных J.S. Amenta . Количественное значение отдельных фракций выражали в процентном соотношении от общей суммы нейтральных липидов и фосфолипидов, соответственно.
Средний диаметр и объем эритроцитов в крови определяли на гематологическом анализаторе «Abacus» (Diatron, Австрия). Осмотическую резистентность эритроцитов к изменению концентрации NaCI рассчитывали по методу Б.Л. Эндрю . Для обработки результатов использовали статистический пакет Instat 3,0 (GraphPad. Software Inc. USA, 2005), с функцией проверки соответствия выборки закону нормального распределения. При подсчете статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
3. Основные результаты
Введение этанола экспериментальным животным в течение 7 дней способствовало изменению содержания холестерина и фосфолипидных фракций в мембране эритроцитов. Отмечалось статистически достоверное (по сравнению с контролем) повышение уровня холестерина (ХС) на 15% (р<0,01) (табл.). Согласно литературным данным ХС, примыкая гидроксильными группами к полярным головкам фосфолипидов, является фактором, влияющим на текучесть и механическую прочность мембраны, а также вязко-эластические характеристики, снижая способность эритроцитов к деформации . Известно, что компенсаторным ответом на повреждающее действие этанола является увеличение содержания ХС в мембране, обеспечивающее поддержание упорядоченности ее структуры и сохранение целостности . Именно благодаря холестерину эритроцит может менять свою форму в ответ на метаболические изменения и внешние воздействия .
Также происходит активация фосфолипаз и свободнорадикальное окисление липидов . Анализ фосфолипидного спектра показал увеличение уровня лизофосфатидилхолина (ЛФХ) на 54% (р<0,05) и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) на 67% (р<0,05), относительно контрольных значений, что обусловлено высокой активностью фосфолипаз. Достоверно снизилось количество основных структурных компонентов мембран: фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) на 9% и 37% (р<0,01), соответственно.
Таблица 1 - Влияние экстракта асцидии на липидный состав мембран эритроцитов крыс при интоксикации этиловым спиртом
Фосфолипиды | 1 группа контроль | 2 группа этанол | 3 группа отмена этанола | 4 группа отмена+асцидия |
Холестерин, % | 22,1±0,6 | 25,4±0,8** | ***27,3±0,9** | 21,9±0,9 |
Фосфатидилхолин, % | 41,9±0,6 | 38,5±0,3* | 40,0±0,1 | 43,0±1,0 |
Лизофосфатидилхолин, % | 6,5±0,1 | 10,0±0,08 | ***9,3±0,8* | 6,2±0,05 |
Фосфатидилэтаноламин, % | 21,7±0,4 | 15,9±0,2* | ***18,1±0,4* | 20,0±0,4 |
Лизофосфатидилэтанол-амин, % | 1,5±0,02 | 2,5±0,03* | ***1,7±0,02 | 1,4±0,02 |
Сфингомиелин, % | 12,1±0,2 | 15,9±0,2* | ***19,0±0,7* | 13,5±0,9 |
Фосфатидилинозит, % | 6,3±0,4 | 4,5±0,2** | ***3,3±0,3** | 5,6±0,2 |
Фосфатидилсерин, % | 7,0±0,2 | 8,4±0,2** | ***7,0±0,1 | 7,6±0,3 |
Фосфатидная кислота, % | 2,9±0,04 | 4,3±0,3** | ***1,6±0,1** | 2,7±0,2 |
Примечание: в % от суммы, М+м; * — р<0,05; ** — р<0,01, *** — р<0,001; звездочки справа — сравнение с контролем, слева — со 2-й группой
Обращает на себя внимание повышение величины сфингомиелина (СМ) на 31% (р<0,05), являющегося стабилизатором мембран . Увеличение СМ свидетельствует о защитно-компенсаторной реакции на разжижающее действие этанола . Также отмечалось увеличение количества фосфатидилсерина (ФС) на 19% (р<0,01) и фосфатидной кислоты (ФК) на 48% (р<0,01), что свидетельствует об активации мембраносвязанного фермента Na+-K+-АТФазы, потере калия и усилении проникновения натрия и воды внутрь клетки .
При исследовании размерных характеристик эритроцитов, таких как средний диаметр (СДЭ) и средний объем (СОЭр) после интоксикации этанолом, отмечалось их увеличение по сравнению с таковыми значениями в контроле. Так, СОЭр превышал контрольные значения на 28 % (110±3 мкм против 86±3 мкм в контроле, р<0,001), а СДЭ - на 15% (7,35±0,07 мкм против 6,38±0,02 мкм в контроле, р<0,001). Также отмечался сдвиг порога начала гемолиза эритроцитов до 0,55±0,01% и окончания гемолиза при концентрации 0,45±0,01% NaCl, относительно контрольных значений (начало гемолиза при 0,45±0,01% NaCl, завершение – при 0,35±0,01% NaCl), что свидетельствует о пониженной устойчивости мембран эритроцитов к гемолизирующему агенту.
В период отмены интоксикации этанолом (3-я группа) сохранялся достоверно высокий уровень ХС, превышающий контроль на 23% (р<0,01), что свидетельствует о стрессовой реакции на отмену этанола. Анализ фракционного состава фосфолипидов в 3-й группе показал повышенное содержание ЛФХ, что говорит о сохраняющейся высокой активности фосфолипаз. На 19% (р<0,05) был повышен уровень СМ, относительно контроля. Одновременно отмечалось снижение почти в 2 раза по сравнению с 1-й группой, количества ФИ (р<0,01) и ФК (р<0,01). Следовательно, в период отмены этанола в течение 7 дней полного восстановления липидной составляющей мембран эритроцитов не наблюдается. Также в период отмены начало гемолиза происходило при концентрации NaСl 0,50 ± 0,01%, а полный гемолиз наблюдался при концентрации NaCl 0,40 ± 0,01%, что достоверно (р<0,01) отличалось от таковых величин в контроле. При этом средний объем эритроцитов был равен 100 ± 4 мкм3 (р<0,05), а средний диаметр эритроцитов – 6,76 ± 0,04 мкм (р<0,001). То есть, в период отмены сохраняется макроцитоз, который может быть обусловлен стойкостью патологических сдвигов в соотношении групп липопротеинов плазмы крови, влияющих на состав липидов в мембране эритроцитов.
При введении липидного комплекса асцидии в период отмены (4-я группа) содержание холестерина и фосфолипидных фракций в мембране эритроцитов соответствовало таковым величинам в контроле. Так, уровень ХС был снижен до 21,9±0,9%. Анализ фосфолипидного спектра показал восстановление фракционного состава мембран эритроцитов до контрольных значений. Также полностью нормализовались размерные характеристики эритроцитов и их осмотическая резистентность. Причем, следует отметить, что полный гемолиз наблюдался при концентрации 0,30±0,01% NaCl, что на 14% ниже таковой концентрации в контроле. Следовательно, липидный комплекс асцидии не только восстановил устойчивость мембран к снижению концентрации NaCl, но и расширил границы осмотической резистентности.
Полученные результаты свидетельствуют о мембранопротекторном эффекте липидного комплекса. Это связано с его химическим составом. Благодаря заместительному эффекту эссенциальных фосфолипидов и полиненасыщенных жирных кислот, происходит ликвидация дефектов липидного бислоя эритроцитарных мембран, вызванных этанолом. В результате чего происходит восстановление липидных структур мембран, улучшаются их эластические свойства.
4. Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о нарушении структурной организации мембран эритроцитов при интоксикации этиловым спиртом, что требует необходимость профилактической фармакокоррекции. Применение липидного комплекса асцидии позволяет нормализовать липидный спектр мембран эритроцитов и показатели осмотической устойчивости эритроцитов, нарушенные этанолом, а также восстановить до исходных значений физиологические характеристики клеток крови. Применение липидных комплексов, содержащих «морские» липиды, выделенные из морских гидробионтов, в частности из туники асцидии пурпурной, может быть полезным и перспективным в комплексной реабилитации больных алкоголизмом.