ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ИНФРАКРАСНОГО СПЕКТРА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭРИТРОЦИТОВ IN VITRO

ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ИНФРАКРАСНОГО СПЕКТРА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭРИТРОЦИТОВ IN VITRO

Научная статья

Катюхин Л.Н.*

ORCID: 0000-0003-2176-4862,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (lion[at]iephb.ru)

Аннотация

Представлены результаты изменений агрегационных и деформационных показателей эритроцитов при воздействии на кровь крыс излучением инфракрасного спектра широкого диапазона. Показано неопосредованное тепловым действием поддержание нативных реологических свойств красных клеток. Подтверждено проявление неспецифического феномена адаптивных возможностей крови теплокровных при стрессе и патологии в результате морфологических трансформаций красных клеток. Феномен проявляется в регуляции вязкостного гомеостазиса крови зрелыми эритроцитами за счет реципрокных последствий прямой положительной связи их реологических детерминант.

Ключевые слова: эритроциты, эктацитометрия, агрегация, инфракрасный свет.

EFFECT OF INFRARED SPECTRUM EMISSION ON RHEOLOGICAL INDICATORS OF ERYTHROCYTES IN VITRO

Research article

Katyukhin L.N.*

ORCID: 0000-0003-2176-4862,

Federal State Budgetary Institution of Science, I.M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia

* Corresponding author (lion[at]iephb.ru)

Abstract

The results of changes in aggregation and deformation parameters of erythrocytes in the blood of rats are presented at its exposition by the emission of a wide infrared spectrum. It is shown that thermal action does not mediate maintenance of the native rheological properties of red cells. The manifestation of the nonspecific phenomenon of the adaptive capabilities of the blood of hematothermal animals under stress and pathology as a result of morphological transformations of red cells was confirmed. The phenomenon manifests itself in the regulation of viscous homeostasis of the blood by mature red blood cells due to the reciprocal consequences of direct positive connection of their rheological determinants.

Keywords: erythrocytes, ektacytometry, aggregation, infrared light.

Многовековой опыт человечества свидетельствует, что согревающее тепло оказывает лечебное действие при восстановлении от различных травм, ушибов, растяжений, способствует заживлению ран, рассасыванию гематом, т.е. обладает выраженным реабилитационным эффектом. Инфракрасный свет проникает в кожу достаточно глубоко и достигает густой сети поверхностных микрососудов. Считается, что основой лечебного эффекта инфракрасного излучения на внутренние органы является прогревание тканей организма. Действительно, при падении длинноволнового инфракрасного излучения на кожный покров расслабляются гладкие мышцы кровеносных сосудов, вследствие чего они расширяются. При этом ускоряется кровоток, улучшается процесс кровообращения. Однако трудно предположить, что излучение может непосредственно повышать температуру крови, протекающей по капиллярам с достаточно высокой скоростью. Кровь имеет высокую теплоемкость, а внутренняя температура тела и даже поверхностных слоев кожи стабилизирована в узком диапазоне за счет функционирования разнообразных физиолого-биохимических механизмов. Очевидно, что организм животных подобно растениям под действием радиации Солнца в процессе эволюции выработал специальные механизмы поглощения и утилизации лучистой энергии, но биохимические основы взаимодействия излучения с живыми клетками до конца не охарактеризованы [1].

Физиологическая и биохимическая активность клеток зависит от функционирования их мембранных систем. Поэтому эритроциты, как первичные акецепторы, меняя свои барьерные свойства, могут служить пусковым звеном физиологических процессов, инициируемых излучением. Ввиду отсутствия корректных сведений об изменении агрегационных и деформационных параметров эритроцитов, и для исключения прямого теплового действия инфракрасного излучения мы провели изучение реологических характеристик красных клеток в термостабилизированных условиях, располагая пробы на тающем льду.

Приборы и методы исследования

Исследованы реологические свойства эритроцитов крови 12 крыс-самцов одного возраста линии Вистар. Методом пьезодинамической агрегометрии в микрообъеме в собственной модификации [2] оценивали способность эритроцитов к спонтанной агрегации. Измерялись следующие агрегационные параметры: прочность агрегатов эритроцитов Тполн, скорость агрегации 1/Тагр, где Тагр-полупериод агрегации, и интегральный индекс агрегации как Iагр=Тполн/Тагр. Деформационные свойства эритроцитов оценивали с помощью метода градиентной осмотической эктацитометрии [3]. Деформационные параметры следующие: интегральная деформируемость (Iдеф), структурная целостность, или водная проницаемость мембран (Iмин) [4], параметр Омин, оценивающий форму, или удельную поверхность эритроцитов (S/V), и параметр Огипер, по величине которого судят о степени дегидратации гемоглобина. Облучение 5 мл цельной стабилизированной гепарином в концентрации 100 ед/мл крови производили полным спектром инфракрасного излучения (ИКО) спектрофотометра SPECORD  M82 в течение 3 часов в кювете площадью 1 Cм², помещенной в наполненную тающим льдом пенопластовый контейнер. Для уменьшения испарения кювету покрывали пластиной из CsI с диапазоном оптической прозрачности 0,25-55,0 мкм, изолирующей фотометрический отсек. Контрольные пробы располагали в соседнем отсеке. Измерения параметров эритроцитов у контрольных животных производили через 3 часа после декапитации. Данные оценивались с помощью прикладной программы Excel 5. Цифровые и графические результаты представлены среднеарифметическими значениями с их стандартными среднеквадратическими отклонениями. Достоверность отличий подсчитана с применением t-критерия Стьюдента  для 5%-ного уровня значимости.

Результаты исследования

Произведенные эксперименты показали, что реологические параметры эритроцитов изменяются по отношению к контрольным значениям однонаправленно как в результате инкубации крови без ИКО, так и после ИКО. Как видно из рисунка 1, хранение проб на льду в отсутствие освещения вызвало достоверное уменьшение деформируемости эритроцитов (параметр Iдеф)  (таблица 1), увеличение водной проницаемости (Iмин) и дегидратацию гемоглобина эритроцитов (Огипер), на что указывает смещение в гипоосмотическую область правого крыла осмоскана [5]. Дискоидная форма эритроцитов не изменилась (см. табл., Омин).

Рис. 1 – Осмограммы эритроцитов

Примечание: контроль (•), без ИКО (O), с ИКО (∆)

 

Таблица 1 – Реологические показатели эритроцитов

Примечание: *- p<0.05.  

После ИКО деформируемость не отличалась от контрольной, а  водная проницаемость-таки достоверно повышалась, но значительно меньше, чем без ИКО. А вот дискоидность эритроцитов, или S/V, увеличилась. Гемоглобин дегидратирован только в виде тенденции.

В отсутствие ИКО, судя по изменениям  параметров Тполн, 1/Тагр и, соответственно, Iагр, прочность агрегатов эритроцитов достоверно понизилась. Под влиянием ИКО динамика этих изменений аналогична, но, как показывает статистический обсчет, только в виде тенденции (см. рис.2). На рисунке 3 представлены результаты корреляционного анализа взаимоизменений  деформируемости эритроцитов и скорости их спонтанной агрегации: достоверной связи реологических детерминант эритроцитов после.

Рис. 2 – Агрегограммы эритроцитов

Примечание: контроль (•), без ИКО (O), с ИКО (∆)

Рис. 3 – Регрессионные зависимости деформируемости и скорости агрегации эритроцитов

Примечание: контроль (•), без ИКО (O), с ИКО (∆)

 

ИКО и в контроле не выявляется. Однако при хранении на льду в течение 3 часов в отсутствие ИКО выявляется достоверная прямая положительная связь реологических детерминант, близкая к функциональной.

Обсуждение результатов

ИКО в современной медицинской практике используется для успешной терапии чрезвычайно широкого круга заболеваний. Замечен биологический эффект дальних инфракрасных лучей на заживление ран. Даже при заболеваниях сердечнососудистой системы стали применять облучение крови больных светом газового гелий-неонового лазера, имеющего многомодовую характеристику спектра. Электромагнитные излучения  в широком диапазоне вызывают уменьшение скорости оседания эритроцитов, предохраняя их от механического разрушения, задерживают появление в крови патологических эритроцитов, увеличивая их дискоидность [6], [7].

Биостимулирующее действие различных энергетических доз ИКО широко документировано в литературе. Низкоинтенсивное ИКО крови снижает уровень перекисей, увеличивает активность ацетилхолинэстеразы мембраны красных кровяных клеток, индуцируя долгосрочные конформационные переходы в клеточной мембране [8], [9]. Это приводит к изменениям структурных состояний и мембранных белков, и липидного бислоя, т.е. увеличению  текучести мембран в гидрофобных и гидрофильных областях [10], [11]. Считается, что в инфракрасной области энергии фотонов достаточно только для увеличения энергии колебательных процессов биологических молекул. По этой причине действие ИКО на организм иногда связывают только с тепловым эффектом в поверхностных тканях. Но при совпадении характеристической с частотами внешнего воздействия вполне ожидаемы изменения функциональной активности биологических систем. Таким образом, результат воздействия излучения на кровь и эритроциты уже не рассматривается как тепловой эффект [25]. Чувствительность живых организмов к действию низкоинтенсивного ИКО сегодня связывается с неравесностью систем, находящихся в метастабильных состояниях. В отношении реакции крови предполагается, что в красном диапазоне именно молекула гемоглобина является первичным фотоакцептором света. С учетом влияния на фракцию гемоглобина, связанную с мембраной, ИКО может вызывать конформационные перестройки белок-липидных взаимодействий и мембранного транспорта ионов и воды [13].

В данном исследовании мы попытались исключить эффект теплового воздействия на кровь, стабилизировав температуру образцов при 0^оC. С помощью современных высокочувствительных методов оценены изменения реологических параметров эритроцитов при облучении проб крови широким спектром ИКО in vitro. Как показано,  облучение проб крови демпфирует снижение реологических свойств эритроцитов, наблюдаемое при их длительном хранении, когда деформируемость эритроцитов ухудшается как за счет снижения вязкоэластических свойств мембран, так и в результате обезвоживания гемоглобина и соответственно повышения внутренней вязкости. Возможна потеря осмотической силы ионных насосов при хранении крови, что приводит к потере упругости изоволемической сферы в точке Омин, где эритроциты набухают до изотропной сферы. В свежей крови у нативных  эритроцитов, когда еще нет дефицита АТФ и не произошла модификация белков, тургор мембраны и мощность насосов достаточны для сопротивления сдвигу при измерении, и в этой точке деформируемость минимальна (параметр Iмин). При длительном хранении даже набухший до изоволемической сферы эритроцит, мембрана которого при физиологических напряжениях сдвига нерастяжима [14], приобретает способность деформироваться в ячейке Куэтта при осмотических условиях, соответствующих Омин. Следовательно, происходит утечка воды из клетки, и индекс деформируемости в этих условиях повышается. С другой стороны, процесс объединения эритроцитов в агрегаты является сложным и многофакторным, по-видимому, связанным с деформациоными свойствами. Как состояние определенных мембранных белков, так и белков плазмы, покрывающих клеточную поверхность, влияет на агрегацию эритроцитов и не остается безучастным при морфологических трансформациях [2], [15].

Нами подтверждено проявление неспецифического феномена адаптивных возможностей крови теплокровных, проявляющееся при стрессе и патологии в результате морфологических трансформаций красных клеток. Он представляет собой регуляцию вязкостного гомеостазиса крови зрелыми эритроцитами за счет реципрокных последствий прямой положительной связи  реологических детерминант эритроцитов [2]. Как следует из данных корреляционного анализа, в контрольных пробах деформируемость и скорость агрегации не обнаруживают связи. Хранение же крови в течение 3 часов даже на льду вызывает тесную прямую положительную связь между ними,  близкую к функциональной. Однако, помещение проб в поток ИКО возвращает связь между ними, точнее ее отсутствие, к нормальному соотношению, оказывая нормализующее действие на утрачивающие свои нативные функциональные свойства эритроциты при длительном хранении.

Выводы

Облучение крови инфракрасным светом приводит к восстановлению частично утраченных при хранении деформационных и агрегационных свойств эритроцитов, что способствует поддержанию нативных реологических параметров эритроцитов.

Подтвержден феномен неспецифической связи реологических детерминант, представляющий собой дополнительный механизм адаптивных возможностей организма по регуляции вязкостных свойств крови зрелыми эритроцитами у млекопитающих.

Финансирование Работа выполнена в рамках государственного задания ФАНО России «Физиологические механизмы адаптации человека и животных к экстремальным и периодически меняющимся геогелиофизическим и метеорологическим факторам» AAAA-A18-118012290142-9.	Funding The work was carried out within the framework of the state task of the Russian Academy of Sciences "Physiological mechanisms of human and animal adaptation to extreme and periodically changing geo-heliophysical and meteorological factors" AAAA-A18-118012290142-9.
Конфликт интересов Не указан.	Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Medenica L. The use of polarised polychromatic non-coherent light alone as a therapy for venous leg ulceration / L. Medenica, M. Lens // Journal of Wound Care. - 2003.- Vol. 12.-№ l. - P. 37-40. doi: 12968/jowc.2003.12.1.26456
2. Katiukhin L.N. Erythrocyte shape transformation in physiological regulation of blood viscosity / N. Katiukhin // Open J. of Mol. and Integr. Physiol. - 2013. - Vol. 3. - № 4 - P. 194-198. http://dx.doi.org/10.4236/ojmip.2013.34025
3. Johnson R.M. Ektacytometry of red blood cells /M. Johnson // Meth. Enzymol. - 1989. - Vol. 173(T). - P. 35-54. PMID: 2779431
4. Katiukhin L.N. A method for evaluation of membrane permeability for water by the erythrocyte osmotic deformability profiles / L.N. Katiukhin // Exp. Biol. and Med. - 2014. - Vol. 157.- № 1. - P. 116-118. doi: 10.1007/s10517-014-2505-1.
5. Clark M.R. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance / M.R. Clark, N. Mohandas, S.B. Shohet // Blood. - 1983. - Vol. 61.- №5. - P. 899-910. PMID: 6831052.
6. Komorowska M. Erythrocyte response to near-infrared radiation / M. Komorowska, A. Cuissot, A. Czarnołeski et al. // Photochem. Photobiol. B. - 2002. - Vol. 68.- №2-3. - P. 93-100.  PMID: 12468203
7. Blot S.I. The use of laser Doppler imaging in measuring wound-healing progress / S.I. Blot, S.J. Monstrey // Arch Surg. - 2001. - Vol. 136.- № 1. - P. 116. PMID: 11146792
8. Chludzińska L. Near-infrared radiation protects the red cell membrane against oxidation / Chludzińska, E. Ananicz, A. Jarosławska et al. // Blood Cells Mol Dis. - 2005.- Vol. 35.- № 1. - P.74-79. doi: 10.1016/j.bcmd.2005.04.003
9. Kujawa J. The effect of near-infrared MLS laser radiation on cell membrane structure and radical generation / J. Kujawa, K. Pasternak, I. Zavodnik et al. // Lasers Med. Sci. - 2014. - Vol. 29.- № 5. - P. 1663-1668. doi: 10.1007/s10103-014-1571-y
10. Kujawa J. Effect of low-intensity (3.75-25 J/cm2) near-infrared (810 nm) laser radiation on red blood cell ATPase activities and membrane structure / J. Kujawa, L. Zavodnik, I. Zavodnik et al. // Clin. Laser Med. Surg. - 2004. - Vol. 22.- № 2.- P.111-117. PMID: 15165385
11. Pasternak K. Influence of MLS laser radiation on erythrocyte membrane fluidity and secondary structure of human serum albumin / K. Pasternak, Nowacka , D. Wróbel et al. // Mol. Cell. Biochem.-  2014. - Vol. 388. - № 1-2. - P.261-267. doi: 10.1007/s11010-013-1917-y
12. Walski T. Near infrared light induces post-translational modifications of human red blood cell proteins / T. Walski, Dyrda, M. Dzik et al. // Photochem. Photobiol. Sci. - 2015.-  Vol. 14.- № 11. - P. 2035-2045. doi: 10.1039/c5pp00203f
13. Yanhong C. Reactive effect of low intensity He-Ne laser upon damaged ultrastructure of human erythrocyte membrane in Fenton system by atomic force microscopy / Yanhong, G. Zhouyi, Z. Yanping et al. // Acta Biochim Biophys. Sinica.- 2007. - Vol. 39.- № 7. - P.484-489. PMID: 17622467
14. GarciaG. Thermodynamics of biological processes / H.G. Garcia, J. Kondev, N. Orme et al. // Methods Enzymol.- 2011. - Vol. 492. - P. 27–59. doi: 10.1016/B978-0-12-381268-1.00014-8
15. Bazanovas A.N. Erythrocyte: A systems model of the control of aggregation and deformability / A.N. Bazanovas,I. Evstifeev,  S.F. Khaiboullina et al.//Biosystems.- 2015.-Vol.131.- P. 1-8. doi: 10.1016/j.biosystems.2015.03.003