ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОРОД КУР РАЗНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ПО INDEL-МУТАЦИИ В ПРОМОТОРЕ ГЕНА ПРОЛАКТИНА

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОРОД КУР РАЗНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ПО INDEL-МУТАЦИИ В ПРОМОТОРЕ ГЕНА ПРОЛАКТИНА

Научная статья

Митрофанова О.В.^1, *, Дементьева Н.В.², Крутикова А.А.³

¹ ORCID: 0000-0003-4702-2736;

² ORCID: 0000-0003-0210-9344;

³ ORCID: 0000-0003-2561-145X;

^1,2,3 Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста», Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (mo1969[at]mail.ru)

Аннотация

Проведена оценка частоты встречаемости indel-полиморфных вариантов в промоторе гена пролактина у кур биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ. Для анализа были взяты двадцать пород разного направления продуктивности. В большинстве изученных популяций наблюдался полиморфизм в этом участке гена пролактина, встречались гетерозиготы in/del, а также оба вида гомозигот. У китайских шелковых и карликовых кохинхинов полиморфизм по этому гену отсутствовал, встречались лишь гомозиготы del/del. Гомозиготы по делеции с высокой частотой были обнаружены так же и у бентамок, нью-гемпширов, суссексов Но у них встречались и гетерозиготы in/del, хотя и с небольшой частотой. Высокая частота встречаемости гомозигот in/in отмечена у голландских белохохлых кур.

Ключевые слова: куры, пролактин, indel- полиморфизм, биоресурсная коллекция, частоты генотипов, частоты аллелей.

GENETIC HETEROGENEITY OF BREEDS OF HENS OF DIFFERENT DIRECTIONS OF PRODUCTIVITY BY INDEL-MUTATION IN THE PROMOTER OF THE PROLACTIN GENE

Research article

Mitrofanova O.V.¹, *, Dementieva N.V.², Krutikova A.A.³

¹ ORCID: 0000-0003-4702-2736, PhD in Biology,

² ORCID: 0000-0003-0210-9344, PhD in Biology,

³ ORCID: 0000-0003-2561-145X, PhD in Biology,

^1,2,3 All-Russian Research Institute of Genetics and Breeding of Agricultural Animals – a branch of the Federal State Budget Scientific Institution, Federal Scientific Center for Animal Husbandry – AUIAB named after L.K. Ernst, St. Petersburg, Russia

* Corresponding author (mo1969[at]mail.ru)

Abstract

The frequency of occurrence of indel-polymorphic options in the promoter of the prolactin gene in chickens of the bioresource collection of VNIIGRZH is estimated in the paper. Twenty species of different directions of productivity were taken for analysis. In the majority of studied populations, polymorphism was observed in this region of the prolactin gene, in/del heterozygotes, and also both types of homozygotes were encountered. The Chinese silk and dwarf cochins had no polymorphism for this gene, only the del/del homozygotes were encountered. Homozygotes for deletion with a high frequency were also found in bantam, new Hampshires, and Sussexes. But they also had in/del heterozygotes, albeit with a small frequency. A high incidence of in/in homozygotes was noted in Dutch white-hens.

Keywords: chickens, prolactin, indel-polymorphism, bioresource collection, frequencies of genotypes, frequencies of alleles.

Человеческий фактор оказался решающим в процессе создания биоразнообразия пород и популяций домашних кур. Несмотря на высокую долю промышленной птицы в современном птицеводстве сохраняются и продолжают разводится редкие и малочисленные группы. Они пользуются спросом у любителей-птицеводов, а также служат хорошей базой для изучения закономерностей наследования различных фенотипических и продуктивных признаков.

Благодаря бурному развитию методов молекулярной генетики к настоящему времени структура ДНК домашней курицы полностью расшифрована. В различных базах данных накоплено огромное количество информации об отдельных генах и некодирующих последовательностях, постоянно выявляются все новые полиморфизмы ДНК, идет анализ взаимосвязей генов с признаками.

Современные исследования направлены на поиск различных вариантов полиморфизма, которые могут оказаться связанными с хозяйственно-полезными признаками. У кур это особенно актуально, поскольку для них характерна быстрая смена поколений. Это дает селекционеру шанс получить эффект селекции в течение незначительного времени, если вести отбор по генам-кандидатам важных признаков.

Пролактин, являясь одним из эффекторных гормонов передней доли гипофиза, по своему химическому составу относится к пептидным гормонам. Он входит в семейство пролактиноподобных белков, которое включает в себя также соматотропин, пролиферин, плацентарный лактоген. Эти гормоны отличает не только сходная структура, но и близкие биологические свойства. У птиц пролактин оказывает ярко выраженное влияние на репродуктивные показатели [1, С. 2].

Ген пролактина у кур ассоциирован с хромосомой 2 и состоит из пяти экзонов и четырех интронов [2, С. 473]. Активный поиск полиморфизмов этом гене направлен как на выявление однонуклеотидных замен (single nucleotide polymorphisms, SNP), так и мутации на основе вставки-удаления участка гена (indel - мутация) [3, С. 4].

У кур выявлены взаимосвязи между отдельными SNP в 2-х экзонах и интронах гена пролактина с показателями живой массы и возрастом наступления половой зрелости, а замена в экзоне 5 – с яйценоскостью [4, С. 132]. У гусей найдена связь C/T - полиморфизм в экзоне 5 пролактинового гена с яйценоскостью и массой яйца [5, С. 66]. Обнаружено влияние на продуктивные показатели кур С/Т локуса, расположенного 5'-нетранслируемой области в этом гене [6, С. 1072].

Мутация по indel-типу в виде вставки длиной 24 пары нуклеотидов, выявленная в промоторной области пролактинового гена в положении 358, положительно ассоциировалась с яйценоскостью птицы, а также влияла на уменьшение инстинкта насиживания [7, С. 394], [8, С. 86]. Выявлено влияние полиморфизмов в пролактиновом гене кур на показатели массы тела [9, С. 843].

Основная цель настоящей работы – проанализировать частоту встречаемости полиморфизма, основанного на инсерции-делеции размером 24 п.н. в промоторной области пролактинового гена кур.

Материалом для работы являлась ДНК, выделенная из крови кур ряда пород биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ различного направления продуктивности (табл. 1).

 

Таблица 1 – Направление продуктивности пород кур, оцененных по indel-полиморфизму в гене пролактина

Порода кур	n	Направление продуктивности
Узбекская бойцовая	20	Бойцовая
Московская бойцовая	20	Бойцовая
Голландская белохохлая	15	Декоративная
Султанка	20	Декоративная
Бентамка ситцевая	20	Декоративная
Китайская шелковистая	15	Декоративная
Кохинхин карликовый	14	Декоративная
Брама палевая	20	Мясная
Кохинхин черный	20	Мясная
Фавероль	15	Мясная
Австралоп черный	9	Мясо-яичная
Черно-пестрый австралорп	20	Мясо-яичная
Амрокс	20	Мясо-яичная
Андалузская голубая	11	Мясо-яичная
Суссекс светлый	47	Мясо-яичная
Нью-гемпшир	20	Мясо-яичная
Аврора	19	Яичная
Итальянская куропатчатая	20	Яичная
Украинская ушанка	18	Яичная
Курчавая	20	Яично-мясная

 

Кровь в объеме 100-500 мкл отбирали в пробирку, содержащую антикоагулянт (200 мМ ЭДТА). После перемешивания образцы замораживали при температуре -20^оС. ДНК выделяли по стандартной методике фенольным методом с использованием протеиназы К («Сибэнзим», Новосибирск). ДНК растворяли в ТЕ-буфере.

Для выявления мутации использовали праймеры, синтезированные компанией «Евроген» (Москва) 5’GGTGGGTGAAGAGACAAGGA-3’ (прямой) и 5’- TGCTGAGTATGGCTGGATGT-3’ (обратный). ПЦР проводили в общем объеме 10 мкл, содержащем 1 ед. Taq - полимеразы, по 0,15 mМ каждого dNTP, по 0,3 мкм каждого праймера  и 100-150 нг ДНК.

ПЦР проводили по схеме: 1) первоначальная денатурация (95°С, 5 мин); 2) денатурация - 95°С (15 сек); 3) отжиг праймеров - 60°С (15 сек); 4) синтез цепи - 72°С (15 сек); 5) финальный синтез - 72°С (10 мин). Этапы 2-4 повторяли последовательно 30 раз. Амплификацию проводили на термоциклере Bio-rad (США).

Ампликоны разгоняли в горизонтальном 2% агарозном геле в течение 1-1,5 часов в зависимости от степени расхождения фрагментов. Наблюдалось три полиморфных варианта. Гомозиготы in/in были представлены в виде фрагмента ДНК размером 154 пары нуклеотидов, гомозиготы del/del – фрагментом 130 пар нуклеотидов. У гетерозигот in/del можно было наблюдать оба фрагмента на одной дорожке.

Частоту встречаемости генотипов рассчитывали по формуле:

P_A=nAA/N,

где P_A - частота встречаемости особей генотипа АА в популяции, nAA - число выявленных особей с генотипом АА,

N – общее число особей в эксперименте;

P_B=1- P_A

P_B - частота встречаемости особей генотипа ВВ в популяции.

Частоты аллеля А в популяции рассчитывали как сумму частоты встречаемости гомозигот АА с половиной частоты встречаемости гетерозигот АВ. Частота аллеля В вычисляется путем вычитания значения частоты аллеля А  из 1.

В таблице 2 представлены частоты встречаемости генотипов и аллелей по мутации в гене пролактина у кур.

 

Таблица 2 – Частота встречаемости аллелей и генотипов по indel-мутации в промоторной части гена пролактина у кур ряда пород биоресурсной коллекции

Порода	n	Частоты генотипов			Частоты аллелей
		in/in	in/del	del/del	in	del
Узбекская бойцовая	20	0,2	0,55	0,25	0,475	0,525
Московская бойцовая	20	0,05	0,45	0,5	0,275	0,725
Голландская белохохлая	15	0,6	0,333	0,067	0,766	0,234
Султанка	20	0,35	0,5	0,15	0,6	0,4
Бентамка ситцевая	20	0	0,1	0,9	0,05	0,95
Китайская шелковистая	15	0	0	1	0	1
Кохинхин карликовый	14	0	0	1	0	1
Брама палевая	20	0,3	0,45	0,25	0,525	0,475
Кохинхин черный	20	0,15	0,6	0,25	0,45	0,55
Фавероль	15	0	0,6	0,4	0,3	0,7
Австралоп черный	9	0,222	0,556	0,222	0,5	0,5
Черно-пестрый австралорп	20	0,15	0,55	0,3	0,425	0,575
Амрокс	20	0,05	0,4	0,55	0,25	0,75
Андалузская голубая	11	0,09	0,272	0,636	0,23	0,77
Суссекс светлый	47	0,021	0,19	0,765	0,117	0,861
Нью-гемпшир	20	0	0,1	0,9	0,05	0,95
Аврора	19	0,263	0,526	0,21	0,526	0,474
Итальянская куропатчатая	20	0,2	0,3	0,5	0,35	0,65
Украинская ушанка	18	0	0,388	0,612	0,194	0,806
Курчавая	20	0,05	0,45	0,5	0,275	0,725

 

Анализ генетической структуры популяций кур из биоресурсной коллекции по indel-мутации в гене пролактина показал, что практически все группы характеризуются значительным уровнем полиморфизма. Исключение составили представители китайских шелковых кур и карликовых кохинхинов. У них полиморфизм по этому гену отсутствовал, встречались лишь гомозиготы del/del.

Высокая частота встречаемости гомозигот del/del по мутации в промоторной области гена пролактина наблюдалась у бентамок, нью-гемпширов, суссексов. Но у них встречались и гетерозиготы in/del, хотя и с небольшой частотой.

Частота встречаемости делеции в гене пролактина у большинства исследованных особей превосходила частоту встречаемости инсерции. Такая тенденция может негативно сказаться на показателях яйценоскости, поскольку именно наличие в позиции 385 промоторной области гена пролактина вставки 24 пары нуклеотидов связывают со снижением инстинкта насиживания у кур [10, С. 182].

На общем фоне выделяются представители голландской белохохлой породы. У них наблюдалась высокая частота встречаемости гомозигот in/in и гетерозигот in/del, что повлияло и на соотношение частот аллелей в пользу аллеля in. Для этой популяции отмечался хороший уровень интенсивности яйценоскости и стабильность яйцекладки.

Таким образом, большинство проанализированных пород кур из биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ характеризуются полиморфизмом по indel-мутации в промоторной части гена пролактина. Тенденция к повышенной частоте встречаемости делеций в этом участке гена может отрицательно сказаться на таком продуктивном показателе как яйценоскость. 

Финансирование Данное исследование выполнено при финансовой поддержке ФАНО России в рамках ГЗ АААА-А18-118021590138-1 с использованием популяций кур из биоресурсной коллекции ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург – Пушкин).	Funding The study was carried out with the financial support of the FASO Russia within the framework of the GZ AAAA-A18-118021590138-1 with the use of populations of hens from the bioresource collection of the Central Collection of Genetic Collection of Rare and Endangered Chicken Rocks (VNIIGRZH, St. Petersburg-Pushkin).
Конфликт интересов Не указан.	Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Kansaku N. Prolactin and growth hormone in birds: protein structure, gene structure and genetic variation / N. Kansaku, G. Hiyama, T. Sasanami and others // J. Poultry Sci. – 2008. – 45. – P. 1–6.
2. Miao Y.-W. Mapping of the prolactin gene to chicken chromosome / Y.-W. Miao, D.W. Burt, I.R. Paton and others // Anim. Genet. - 1999. - V.30. - P. 473.
3. Liang Y. Polymorphisms of 5’ flanking region of chicken prolactin gene / Y. Liang, J. Cui, G. Yang and others // Domestic Anim. Endocrinol. – 2006. – 30. – P. 1–16.
4. Rashidih H. Association of prolactin and prolactin receptor gene polymorphisms with economic traits in breeder hens of indigenous chickens of Mazandaran province /H. Rashidih, G. Rahimi-Mianjig, A. Farhadia and others // Iran. J. Biotech. - 2012. - V.10.- P. 129-135.
5. Wang C. Polymorphism of the prolactin gene and its association with egg production traits in native Chinese ducks / C. Wang, Z. Liang, W. Yu and others // Afr. J. Anim. Sci. - 2011. - V.41. - P. 64-69.
6. Chen H.-Q. The novel genetic change in 5’-untranslated region of goose prolactin gene and their distribution pattern in different goose breeds / -Q. Chen, H.-Q. Wei, J. Qin and others // Asian J. Anim. Vet. Adv. - 2011. - V. 6. - P. 1069-1075.
7. Kulibaba R.A. Prolactin and growth hormone gene polymorphisms in chicken lines of ukrainian selection / R.A. Kulibaba, A.P. Podstreshnyi // Cytology and Genetics. - 2012. - V.46. - P. 390-395.
8. Jiang R.S. Single nucleotide polymorphisms in the 5’-flanking region of the prolactin gene and the association with reproduction traits in geese / R.S. Jiang, L.L. Zhang, Z.Y. Geng and others // Afr. J. Anim. Sci. - 2009. - V.39. - P. 83-87.
9. Jiang R.S. Association of polymorphisms for prolactin and prolactin receptor genes with broody traits in chickens / S. Jiang, G.Y. Xu, X.Q. Zhang and others // Poultry Science. - 2005. - V.84. - P. 839–845.
10. Mitrofanova O. V. Association of polymorphic variants in MSTN, PRL, and DRD2 genes with intensity of young animal growth in Pushkin breed chickens / V. Mitrofanova,  N.V. Dementeva, A.A. Krutikova and others // Cytology and Genetics. – 2017.- V. 51.- N. 3. - P. 179-184.