Прогностическое значение экспрессии генов, контролирующих систему гемостаза при инфаркте миокарда
Прогностическое значение экспрессии генов, контролирующих систему гемостаза при инфаркте миокарда
Аннотация
На сегодняшний день экспрессия генов-кандидатов, кодирующих белки-активаторы системы гемостаза, рассматривается как дополнительный прогностический параметр для определения «неблагоприятного исхода» сердечно-сосудистых катастроф.
Цель. Оценить уровень экспрессии генов, связанных с нарушением гемостаза, для определения вероятности повторной госпитализации, годовой выживаемости пациентов и прогноза неблагоприятного течения ИБС.
Материалы и методы. В настоящем исследовании приняли участие 61 пациент с острым инфарктом миокарда с подъемом (ИМпST) и без подъема сегмента ST (ИМбпST). Группа контроля была представлена пациентами без ССЗ в анамнезе. Всем участникам исследования была проведена оценка относительного уровня экспрессии 4 генов: генов SERPINE/PAI-1, FGB, ITGA2 и ITGB3, которые в большей степени ассоциированы с нарушением гемостаза у пациентов c кардиоваскулярной патологией.
Результаты исследования. В основной группе установлено достоверное повышение RQ генов SERPINE/PAI-1, ITGB3 по сравнению с группой контроля. В ходе исследования выявлено, что активность генов значительно выше у пациентов младше 60 лет со сниженной сократительной способностью сердца, с умеренно сниженной и сниженной сократительной способностью левого желудочка. Причем был оценен прогноз повторных сердечно-сосудистых катастроф в течение года после госпитализации в группах пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением.
Заключение. Таким образом, экспрессия генов SERPINE/PAI-1, ITGB3 может служить дополнительным прогностическим маркером тяжести течения сердечно-сосудистых катастроф.
1. Введение
За последние 10 лет более половины смертей в нашей стране произошла по причине сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Причем их большая часть связана с острыми и хроническими формами ишемической болезни сердца (ИБС) . Среди них есть пациенты очень высокого риска, в том числе, с рецидивирующим течением ССЗ, что заставляет вести поиск новых предикторов, обладающих особой прогностической ценностью. В настоящее время значительное внимание уделяется изучению воздействия активности различных генов-кандидатов, контролирующих систему гемостаза, при данных патологических состояниях .
В современной литературе появляется все больше данных о тесной связи SERPINE-1/PAI-1 (гена, кодирующего ингибитор активатора плазминогена – 1), FGB (гена, кодирующего бета-полипептидную цепь белка фибриногена), ITGA2 (гена, кодирующего белок интегрин альфа-2) и ITGB3 (гена, кодирующего белок интегрин бета-3) с тяжестью течения и развитием ССС , .
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилась оценка уровня экспрессии генов, связанных с нарушением гемостаза, для определения вероятности повторной госпитализации, годовой выживаемости пациентов и прогноза «неблагоприятного» течения ИБС.
2. Методы и принципы исследования
В настоящем исследовании приняли участие 61 пациент с острым инфарктом миокарда 65,50 ± 16,50 года (от 43 до 82 лет). Группа контроля была представлена пациентами без ССЗ (n=18). В анамнезе у пациентов группы контроля не отмечено ишемической болезни сердца, клапанных пороков и артериальной гипертензии. Все пациенты из группы контроля имели низкий сердечно-сосудистый риск (в среднем ЛПНП было менее 3 ммоль/л). Возраст пациентов группы контроля 38,00±8,00 (от 30 до 46 лет). Всем пациентам была проведена оценка относительного уровня экспрессии генов, контролирующих систему гемостаза: SERPINE/PAI-1, FGB, ITGA2 и ITGB3. При этом экспрессия генов в группе контроля была принята за единицу. Согласно полученным результатам относительно экспрессии целевых генов, все пациенты с сердечно-сосудистыми событиями (ССС) были разделены на две группы.
1 — с неблагоприятным течением инфаркта миокарда (ИМ) (n=38);
2 — с благоприятным течением (n=23).
Критерии неблагоприятного течения инфаркта миокарда были определены на основе априорного отбора клинических и лабораторно-инструментальных факторов, доказавших свою прогностическую значимость в крупных многоцентровых исследованиях и систематических обзорах. В окончательную модель были включены следующие показатели: возраст старше 60 лет, наличие хронической болезни почек (ХБП) со скоростью клубочковой фильтрации (СКФ)<60 мл/мин/1,73 м2, фракция выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ)<49%, артериальное давление (АД)<90/60 мм рт ст (нестабильная гемодинамика), частота сердечных сокращений (ЧСС)>90 уд/мин на момент поступления, дислипидемия, стентированные коронарные артерии (КА) и уровень экспрессии исследуемых генов. Проведён регрессионный анализ для валидации критериев, ассоциированных с неблагоприятным течением сердечно-сосудистого события. Анализ экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени на приборе CFX96 (Bio-Rad, США) на основе TaqMan-технологии с использованием коммерческих наборов (Applied BioSystems, США) смеси праймеров (короткая олиго- или полинуклеотидная последовательность со свободной З’ОН-группой, комплементарно связанная с однонитевой ДНК или РНК; с его 3’-конца ДНК-полимераза начинает наращивать полидезоксирибонуклеотидную цепь) и зондов (короткий отрезок ДНК или РНК известной структуры или функции, меченный каким-либо радиоактивным или флуоресцентным соединением). При оценке относительного уровня экспрессии генов (RQ) использовался метод 2–ΔΔCT, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия целевых генов у исследуемых групп по сравнению с группой контроля. Определение уровня экспрессии целевых генов проводили относительно референсного гена бета актина (ACTB). ΔΔCt — количество циклов, которое необходимо для пороговой экспрессии генов (RQ). ΔΔCt рассчитывали как ΔΔCt = ΔCt (исследуемой группы) — ΔCt (группы контроля). Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.8.0 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Для статистического анализа был использован непараметрический метод — U-критерий Манна-Уитни. Статистическая значимость определялась при уровне p<0,01. Для факторов с тремя категориями количество пораженных артерий и стентированные коронарные артерии применена поправка Бонферрони. Для анализа качественных признаков применялся критерий χ2 с уровнем значимости p<0,05. Прогностическая модель, описывающая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с использованием метода логистической регрессии.
3. Основные результаты
Средний возраст пациентов с ССС составил 65,50 лет (± 16,50), среди них 23,12% женщин и 76,88% мужчин. На момент поступления 24,91% пациентов имели АД в целевом диапазоне, тогда как 26,72% столкнулись с нестабильной гемодинамикой. Около половины пациентов показали сниженные или умеренно сниженные показатели ФВ ЛЖ (n=29, среднее значение ФВ=43,31%, медиана соответствует 44,50%). Лишь 7,69% (среднее значение ЛПНП 1,13 ммоль/л, медиана 1,14 ммоль/л) пациентов достигли целевого уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), в то время как остальные имели более высокие показатели. Более половины пациентов страдали от поражения нескольких КА. В 41% случаев инфаркт-зависимой КА была передняя межжелудочковая ветвь (ПМЖВ).
Анализ RQ исследуемых генов показал, что в группе пациентов с ССС наблюдается статистически значимое увеличение экспрессии генов PAI-1 и ITGB3 по сравнению с контрольной группой (p<0,01). При этом количество циклов ΔΔCt, необходимое для достижения порогового уровня экспрессии этих генов, было значительно меньше, чем для генов FGB и ITGA2 (табл. №1).
Уровень экспрессии генов, контролирующих гемостаз, у пациентов с кардиоваскулярными заболеваниями
RQ – уровень экспрессии гена, относительно группы сравнения, принятой за 1; ΔΔCt – количество циклов достижения пороговой экспрессии гена; * – статистически значимая разница относительно группы сравнения, принятой за 1, p<0,05; ** – статистически значимая разница относительно группы сравнения, p≤0,01
| PAI-1 | FGB | ITGA2 | ITGB3 |
RQ ДИ 95% [25;75] | 3,35 [2,81; 4,00] * | 0,01 [-0,36; 0,33] | 0,68 [0,55; 0,87] | 5,02 [2,98; 7,56] ** |
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | 8,45 [6,56-11,77] ** | 8,73 [7,40-10,86] | 2,21 [0,30-4,44] | 0,76 [-1,72-4,54] ** |
p | p≤0,01 | p=0,05 | p=0,05 | p≤0,01 |
На следующем этапе исследования был проведен сравнительный анализ активности упомянутых генов с учетом возраста пациентов, величины ФВ ЛЖ, объема поражения коронарного русла и вида стентирования КА. Пациенты с ССС были разделены на две группы по возрастному критерию: младше 60 лет и старше 60 лет. У пациентов старше 60 лет чаще осуществлялось стентирование ПМЖВ левой коронарной артерии (ЛКА). В группе пациентов младше 60 лет была выявлена гиперэкспрессия гена PAI-1 (7,34; p ≤ 0,05). В зависимости от уровня ФВ ЛЖ пациенты были разделены на две подгруппы: с ФВ<49% и > 50%. У пациентов с ФВ ЛЖ <49% наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии гена ITGB3 (5,84; p ≤ 0,05). В соответствии с клинической характеристикой, поражение трех и более КА преимущественно регистрировалось у мужчин. У них чаще проводилоcь стентирование ПМЖВ ЛКА, в то время как при однососудистом и двусосудистом поражении стентированию подвергалась, в основном, огибающая ветвь (ОВ) ЛКА. Достоверная гиперэкспрессия ITGB3 наблюдалась у пациентов со стентированием ПМЖВ (5,39; p ≤ 0,05) и ОВ ЛКА (5,17; p ≤ 0,05). В то же время уровень экспрессии SERPINE/PAI-1 был значительно выше у пациентов со стентированной правой коронарной артерией (ПКА) (8,86; p ≤ 0,05) (табл. 2). Для факторов с тремя категориями (количество пораженных коронарных артерий, стентированные коронарные артерии) применена поправка Бонферрони. Исходное различие по объему поражения коронарного русла не является статистически устойчивым (p=0,15), в связи с чем данные по объему поражения коронарного русла не включены в таблицу ниже.
Уровень экспрессии генов в зависимости от возраста, фракции выброса ЛЖ и вида стентированой КА
* – статистически значимая разница относительно группы сравнения, принятой за 1, p<0,05; ** – статистически значимая разница относительно группы сравнения, p≤0,01;
RQ – уровень экспрессии гена, относительно группы сравнения, принятой за 1; ΔΔCt – количество циклов достижения пороговой экспрессии гена;
1 – ЧТКАС ПМЖВ; 2 – ЧТКАС ОВ; 3 – ЧТКАС ПКА
Показатель | Способ группировки | p | ||||
Возраст | < 60 лет (n=21) | > 60 лет (n=40) |
| |||
| PAI-1 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 7,34 [6,38;9,96] * | 1,41 [0,58;1,53] | p≤0,05 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -2,86** [–5,72; 1,08]** | -0,48 [–0,60; 1,09] | p≤0,01 | |||
| ITGB3 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 3,41 [0,82;11,60] | 1,61 [0,84;10,60] | p=0,11 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -1,76 [–9,14; –1,15] | -0,68 [–2,04; 5,03] | p=0,05 | |||
Фракция выброса левого желудочка | ФВ ЛЖ<49% (n=29) | ФВ ЛЖ>50% (n=32) |
| |||
| PAI-1 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 3,88 [0,67; 9,13] | 2,88 [0,57; 11,92] | p=0,37 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -1,95 [–3,82; 1,08] | -1,527 [–2,72; 1,27] | p=0,05 | |||
| ITGB3 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 5,84 [0,09;11,32] * | 0,74 [0,72;1,05] | p ≤ 0,05 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -2,54** [–4,25; 0,35]** | 0,42 [–2,92; 7,40] | p≤0,01 | |||
Стентированные КА | 1.ЧТКАСПМЖВ n=24 | 2. ЧТКАС ОВ n=15 | 3. ЧТКАС ПКА n=22 |
| ||
| PAI-1 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 2,55 [0,61; 9,56] | 2,97 [0,65; 8,74] | 8,86*[4,42; 15,84] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,05 p 1,3 ≤ 0,05 | ||
ΔΔCt Ме[Q1-Q3] | -1,34 [-2,59; 1,32] | -1,57 [-4,06; 1,13] | -3,14**[–5,32; 14,58] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,01 p1,3 ≤ 0,01 | ||
| ITGB3 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 5,39 [0,83;12,38] | 5,17 [0,84;12,26] | 0,33 [0,06;1,07] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,05 p 1,3 ≤ 0,05 | ||
ΔΔCt Ме[Q1-Q3]
| -2,43 [–4,39; 4,12] | –2,37 [–9,14; 4,13] | 1,59[–1,68; 9,46] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,01 p 1,3 ≤ 0,01 | ||
С целью оценки прогностической значимости экспрессии гена PAI-1 в отношении возрастных характеристик (в отношении пациентов < 60 лет) был проведен ROC-анализ, позволяющий определить дискриминационную способность показателя и установить его оптимальное пороговое значение. По результатам анализа установлено, это экспрессия гена PAI-1 является статистически значимым предиктором возраста < 60 лет (AUC=0,75), что соответствует удовлетворительному качеству модели. Чувствительность модели при данном пороге составила 76,90%, специфичность - 62,50%, что свидетельствует о её умеренной диагностической эффективности (рис. 1).
ROC-кривая для PAI-1: предсказание возрастной группы младше 60 лет
ROC-кривая для ITGB3: предсказание низкой и умеренно сниженной ФВ
ФВ ≤ 40%
Модель продемонстрировала высокую прогностическую способность:
Коэффициент множественной корреляции составил rxy = 0,85, что соответствует очень высокой тесноте связи по шкале Чеддока.
Модель в целом была статистически значима (p = 0,006).
Коэффициент детерминации R² = 0,72, что означает, что модель объясняет 72,4% общей вариабельности исхода.
Анализ исхода в зависимости от возраста, ЧСС, уровня АД, креатинина крови, фракции выброса, уровня ЛПНП, RQ PAI-1, RQ ITGB3, объема поражения коронарного русла
* – различия показателей статистически значимы (p < 0,05)
| B | Стд. ошибка | t | p |
Intercept | -1,08 | 0,87 | -1,24 | 0,23 |
Возраст | 0,000 | 0,01 | 0,04 | 0,97 |
ЧСС на момент поступления | 0,01 | 0,00 | 1,50 | 0,15 |
САД менее 90/60 м рт.ст. на момент поступления | -0,01 | 0,01 | -0,90 | 0,38 |
Креатинин на момент поступления | 0,00 | 0,00 | 0,08 | 0,94 |
Фракция выброса | 0,00 | 0,01 | 0,10 | 0,92 |
Уровень ЛПНП | -0,07 | 0,10 | -0,69 | 0,50 |
RQ PAI-1! | 0,00 | 0,00 | 0,64 | 0,54 |
RQ ITGB3 | 0,01 | 0,01 | 2,22 | 0,04* |
Syntax score! | 0,02 | 0,01 | 2,17 | 0,04* |
Далее была проведена оценка повторных госпитализаций. Причем наблюдение проводилось в течение года, после перенесенного ССС. Оценивалась госпитализация, в ходе которой проведена коронароангиогрфия без/с стентированием, госпитализация по другим ССЗ, а также заболеваниям других органов и систем. В группе с неблагоприятным течением мы наблюдали 42,86% (18 из 38) повторных госпитализаций, среди них все пациенты были госпитализированы по заболеванию сердечно-сосудистой системы. 31,05% пациентов госпитализировались с клиникой острого коронарного синдрома, из них у 14,13% был подтвержден диагноз повторного острого ИМ, у 16,92% — нестабильная стенокардия. 22,30% проведено повторное стентирование инфаркт/ишемия-связанной коронарной артерии. 11,69% пациентов госпитализированы по причине пароксизмальной фибрилляции предсердий, с клиникой декомпенсации хронической сердечной недостаточности и гипертонического криза, осложненного острой левожелудочковой недостаточностью и гипертонической энцефалопатией, то есть по причине других ССЗ. У пациентов из группы благоприятного течения результаты имели положительный прогностический характер. 16,15% (4 из 23) повторно госпитализировались в течение года после перенесенной сердечно-сосудистой катастрофы. Различия статистически значимы: χ² = 4,36 (с поправкой Йейтса), p=0,03. Отношение шансов (OR) составило 4,28 (95% ДИ: 1,22-14,97), что указывает на более чем четырёхкратное повышение риска повторной госпитализации при неблагоприятном течении. Из них 9,42% пациента с клиникой острого коронарного синдрома, при этом диагноз острого инфаркта подтвердился только у 3,00% пациентов. 6,58% пациентам проведено стентирование КА. 6,75% пациентов проходили стационарное лечение с фибрилляцией предсердий, клиникой острой левожелудочковой недостаточности на фоне гипертонического криза. 1,63% пациентов повторно госпитализировались ввиду недифференцированного артрита и цирроза печени.
4. Обсуждение
Состояние системы гемостаза у пациентов с очень высоким и экстремальным сердечно-сосудистым риском остается в фокусе современных исследований. Ключевым патогенетическим звеном сердечно-сосудистых событий является атеротромбоз, что обусловливает потребность в новых, более информативных маркерах его развития. Рутинные лабораторные тесты (уровень фибриногена, ПТИ, МНО, стандартная коагулограмма) не всегда отражают комплексные нарушения гемостаза в данной популяции. В этой связи оценка генетических детерминант, регулирующих процессы тромбообразования в коронарном русле, представляется перспективным направлением . В данном исследовании была оценена экспрессия генов SERPINE/PAI-1, FGB, ITGA2 и ITGB3, которые, согласно данным мировой статистики, наиболее ассоциированы с нарушением гемостаза у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. Особое внимание уделялось роли этих генетических факторов в развитии острого коронарного синдрома (ОКС) у пациентов молодого возраста (до 60 лет). В исследовании Sheikhvatan et al. (2019) подчеркивается роль ITGB3 как основного интегрина, ответственного за миграцию гладкомышечных клеток, что может быть ключевым фактором в развитии диффузного поражения коронарных артерий . Ассоциация полиморфизмов ITGB3 с исходами чрескожных коронарных вмешательств подтверждена, в частности, в популяции Бангладеш (Islam et al., 2021) . Среди отечественных исследований стоит обратить внимание на работу Муслимовой Э.Ф., где носительство аллеля 1565C гена ITGB3 сопряжено с риском ИБС . Полиморфизм гена ITGB3, в частности вариант PIA2, ассоциирован с повышенным риском инфаркта миокарда, а также с неблагоприятными исходами после коронарного вмешательств, включая рестеноз и тромботические осложнения . Причем генетические варианты ITGB3 могут быть связаны с ранним развитием атеротромботических событий и худшим ответом на лечение . В нашей работе значение ITGB3 оказалось статистически значимым в группе пациентов очень высокого риска, страдающих от коронарного поражения и перенесших острый инфаркт миокарда. Активность этого гена была тесно связана с фракцией выброса левого желудочка и стентированием ветвей левой коронарной артерии.
Одной из задач нашего исследования было выявление генетических факторов, которые могут способствовать развитию острого коронарного синдрома (ОКС) у пациентов в возрасте до 60 лет. Результаты показали гиперэкспрессию PAI-1 в этой группе, что соответствует данным исследования Hamsten A et al. (1985), где избыток PAI-1 был отмечен у молодых мужчин и женщин, перенесших острый инфаркт миокарда . Подобное исследование было проведено среди молодого индейского населения, однако, была оценена роль полиморфизма 4G/5G гена PAI-1 c развитием ишемического инсульта . Эти данные согласуются с результатами недавнего исследования группы американских ученых, в котором также определена связь полиморфизма гена PAI-1 с развитием инфаркта миокарда у пациентов молодого возраста, что подчеркивает значимость данного фактора в раннем развитии острого коронарного синдрома . Современные исследования подтверждают значимую роль PAI-1 в формировании неблагоприятных исходов после чрескожных коронарных вмешательств. В частности, показано, что повышенный уровень PAI-1 ассоциирован с развитием рестеноза в зоне имплантации коронарного стента .
Эти результаты подчеркивают важность генетических факторов в патогенезе острых коронарных событий и могут служить основой для дальнейших исследований в направлении клинической практики с целью улучшения диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Ограничением исследования можно считать относительно небольшой размер выборки, что могло повлиять на статистическую значимость некоторых показателей. Полученные данные открывают перспективы для клинического внедрения молекулярно-генетических маркеров. Повышенная экспрессия генов ITGB3 и *SERPINE1 (PAI-1)* может быть использована для дополнительной стратификации риска неблагоприятных исходов у пациентов с очень высоким и экстремальным сердечно-сосудистым риском. Разработанная регрессионная модель, объясняющая 72,4% вариабельности исхода, потенциально применима для персонализации прогноза и выбора тактики реваскуляризации. В частности, гиперэкспрессия *PAI-1* у пациентов моложе 60 лет позволяет идентифицировать подгруппу с агрессивным течением атеротромбоза. Внедрение количественной ПЦР-оценки экспрессии данных генов в клиническую практику может повысить точность прогнозирования и обосновать дифференцированную антитромботическую терапию.
5. Заключение
В итоге проведенного исследования было обнаружено значительное повышение уровня относительной экспрессии генов ITGB3 и SERPINE/PAI-1 у пациентов с сердечно-сосудистыми событиями. Пациенты из группа неблагоприятного течения гораздо чаще госпитализировались, особенно с клиникой повторного острого коронарного синдрома, им статистически значимо чаще проводилось стентирование коронарных артерий. Это выраженное увеличение активности генов может указывать на более агрессивное течение заболевания и на его степень тяжести, что подтвердилось результатами наблюдения за пациентами из группы исследования.