ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ АЛЛОПУРИНОЛА ПРИ ИШЕМИЧЕСКИ-РЕПЕРФУЗИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ АЛЛОПУРИНОЛА ПРИ ИШЕМИЧЕСКИ-РЕПЕРФУЗИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Аннотация
Атомарные формы кислорода выступают медиаторами постишемического реперфузионного повреждения в почках. Цель исследования – оценка нефропротективного эффекта аллопуринола при постишемическом реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте. Значения креатинина в группе 2 и 3 достигли максимальных значений к 3-му дню, с момента операции, и спустя 24 часа с момента начала эксперимента в группе 3 показатель мочевины был на 24,9% статистически значимо ниже в сравнении с группой 2, р<0,05. Применение аллопуринола статистически значимо уменьшало функциональные и гистологические нарушения, наблюдаемые на 1-е,3-и и 7-е сутки. Применение аллопуринола при ишемии-реперфузии может иметь колоссальный практический выход, но требуется дальнейшее проведение исследований.
1. Введение
Ишемическая почечная дисфункция наблюдается при многих клинических ситуациях, включая шок, трансплантацию почки и сердечно-сосудистую хирургию. Патофизиологическим механизмом выступает почечная гипоперфузия. Атомарные формы кислорода (АФК) выступают медиаторами постишемического реперфузионного повреждения в почках и других органах
. Применение аллопуринола с целью блокады активности ксантиноксидазы и ингибирования активности АФК является крайне перспективным , . Цель исследования – оценка нефропротективного эффекта аллопуринола при постишемическом реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте.2. Методы и принципы исследования
Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных
. Эксперимент проводился на 30 животных (нелинейные белые крысы обоего пола массой 290-325 г.). Все животные находились в стандартных условиях вивария. Всем животным был предоставлен свободный доступ к стандартному лабораторному корму и воде. Животным выполнен (наркоз), включающее интраперитонеальное введение (и/п) препаратов: «Ксилазин» (0,5 мл/кг массы тела) и «Золетил 100» (8мг/кг массы тела) . Животные были разделены на 3 группы: 1-ая группа (контроль 1) (n=10) ложнооперированные животные, выполнялась срединная лапаротомия. Предварительно вводился гепарин натрия (200 ЕД/кг) в хвостовую вену, брюшная полость накрывалась стерильной салфеткой и ч\з 1 час ушивалась. 2-ая – контроль 2 (n = 10): Выполнялась срединная лапаротомия. Предварительно вводился гепарин натрия (200 ЕД/кг) в хвостовую вену. Ножку левой почки зажимали на 1 ч сосудистым зажимом. В этот период брюшная полость закрывалась стерильной салфеткой. За 5 мин до снятия зажима выполнялась правосторонняя нефрэктомия, после чего происходило ушивание брюшной полости . 3-ья – операция+аллопуринол (n = 10): Животным в данной группе был добавлен в пищевой рацион аллопуринол 50 мг (ОРГАНИКА, АО (Россия)) в сутки из расчета на одно животное (аллопуринол был добавлен в пищу за 24 часа до начала эксперимента, предварительно таблетки измельчались до порошка), животные из этой группы содержались в отдельных клетках. Выполнялась срединная лапаротомия. Предварительно вводился гепарин натрия (200 ЕД/кг) в хвостовую вену. Ножку левой почки зажимали на 1 ч сосудистым зажимом. В этот период брюшная полость закрывалась стерильной салфеткой. За 5 мин до снятия зажима выполнялась правосторонняя нефрэктомия, после чего происходило ушивание брюшной полости . Для оценки уровня мочевины и креатинина, образцы крови были взяты из хвостовой вены по стандартной методике, с использованием стандартных диагностических наборов (анализатор BS-240), в сроки: через 24 часа после операции, на 3й день после операции, и на 7-й день после операции. После вывода животных из эксперимента путем эвтаназии, проводилось гистопатологическое исследование почек (предварительно ткани фиксировали в 10% формальдегиде, обезвоживали в спиртовой серии, обрабатывали толуолом, готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике), делали микрофотографии, отцифровывали их и оценивали изменения. Для статистической обработки был применен t-критерия Стьюдента и критерий Манна-Уитни. Результаты представлены следующим образом, М ± m (М – среднее, m – ошибка среднего). Данные принимались за статистически значимые при р<0,05 .3. Результаты и их обсуждение
Значения креатинина в группе 2 и 3 достигли максимальных значений к 3-му дню, с момента операции (таб. 1), так спустя 24 часа с момента начала эксперимента в группе 3 показатель мочевины был на 24,9% статистически значимо ниже в сравнении с группой 2, р<0,05.
Таблица 1 - Показатели мочевины и креатинина в исследуемых группах
Показатель плазмы крови | Группа 1. Kонтроль 1. Ложнооперированные животные (n = 10), (М±m) | Группа 2. Kонтроль 2. Операция без лечения (n = 10), (М±m) | Группа 3. Операция+аллопуринол (n = 10), (М±m) |
Мочевина, (ммоль/л) | Через 24 часа от начала эксперимента | ||
1,534±0,178 | 5,983± 0,228* | 4,493± 0,662# | |
3й день после операции | |||
1,544±0,478 | 9,273± 0,138* | 6,703± 0,587*# | |
7-й день после операции | |||
1,534±0,181 | 8,653± 1,168 | 5,284± 0,943# | |
Креатинин, (мкмоль/л) | Через 24 часа от начала эксперимента | ||
39,78 ± 7,53 | 49,5 ± 4,51* | 45,08 ± 2,33*# | |
3й день после операции | |||
39,88 ± 7,14 | 89,7 ± 4,68* | 61,13 ± 3,53*# | |
7-й день после операции | |||
39,79 ± 7,11 | 71,5 ± 6,55* | 55,08 ± 4,33*# | |
Примечание: * - статистическая значимость отличия по отношению к группе 1, р<0,05; # - статистическая значимость отличия по отношению к группе 2, р<0,05
В контрольной группе значения стабильно увеличивались до 3-го дня, а затем снижались. Показатель креатинина в группе 3 был статистически значимо ниже по сравнению с контрольной группой во все дни, (p <0,05). Так, наивысший уровень креатинина в группе 3 был зафиксирован на 3-и сутки от начала эксперимента - 61,13 ± 3,53 мкмоль/л, что статистически значимо ниже в сравнении с группой контроль 2, на 31,8%, р<0,05 (таб.1.). При гистологической оценке препаратов максимальное повреждение с выраженным некрозом в дистальной трети проксимального извитого канальца и участком некроза, распространяющегося вдоль мозгового слоя было отмечено у животных в группе №2, в группе №3 также отмечались подобные изменения, но они носили менее выраженный характер, отмечались участки лимфогистиоцитарной инфильтрации стромы, увеличение мезангиального матрикса и дистрофия эпителия канальцев. В отличие от других органов ишемически-реперфузионное повреждение почек уникально в том, что в момент ишемии происходит, и морфологическое, и функциональное повреждение почки
, . В данном исследовании, мы постарались показать, что применение аллопуринола оказывает нефропротективный эффект при ишемически-реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте. В нашем исследовании мы увидели положительный эффект, начиная с ранней фазы реперфузии (24 часа). Эффекты аллопуринола до конца не изучены, и предполагаемые механизмы включают ингибирование образования АФК системой ксантиноксидазы , , и прямое удаление свободных радикалов.4. Заключение
Применение аллопуринола оказывает нефропротективный эффект при ишемически-реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте. Мы предполагаем, что нефропротективное действие аллопуринола при ишемии-реперфузии осуществляется все-таки не через механизм ингибирования ксантиноксидазы, а через стабилизацию митохондриальных мембран, но проверка данной гипотезы требует дальнейших исследований. Во время ранней реперфузии наблюдается снижение общего почечного кровотока, а также притока крови к корковому и мозговому слою, происходит ингибирование канальцевой реабсорбции натрия, хлоридов и воды, тем самым снижается канальцевое потребление кислорода и уменьшается агрегации тромбоцитов, возникающая после повреждения тканей. Применение аллопуринола статистически значимо уменьшало функциональные и гистологические нарушения, наблюдаемые на 1ые, 3-и и 7-е сутки. Применение аллопуринола при шоке, трансплантации почки и сердечно-сосудистой хирургии, может иметь колоссальный практический выход, но требуется дальнейшее проведение исследований, оценки баланса оксидантно-антиоксидантного статуса, модуляции обмена веществ, кроме того, необходимо оценить, каким образом мембранные белки, регулирующие ксантиноксидазу оказывают воздействие при ишемии-реперфузии почек.