ИММУНОГИСТОХИМИЯ CD4 КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

Ялалетдинова Л.Р.¹, Сергеева В.Е.², Ястребова С.А.³

¹Городская больница №5 г Чебоксары; ²доктор биологических наук, профессор, Чувашский государственный университет; 3 кандидат биологических наук, доцент, Чувашский государственный университет

ИММУНОГИСТОХИМИЯ CD4 КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

Аннотация

Проведено иммуногистохимическое исследование микроструктур яичников мыши в норме и при внутримышечном введении 0,02 мл хорионического гонадотропина (ХГ) в течение 1-4 недель. Установлено наличие CD4 позитивных структур в яичниках. Количественное распределение CD4 структур изменяется при различных сроках введения ХГ. Введение ХГ выявило дозозависимое уменьшение CD4 клеток коркового вещества яичников. Через 1 неделю после введения ХГ количество CD4 клеток в корковом веществе уменьшилось в 1,8 раз. Воздействие ХГ в течение 2 недель привело к уменьшению выработки CD4 клеток в 3,6 в сравнении с контрольной группой. Длительное воздействие ХГ в течение 4 недель привело к значительному уменьшению CD4 структур в корковом веществе яичников мыши. В мозговом веществе яичников снижается выявляемость CD4-позитивных структур в через 1 неделю в 1,8 раз, через 4 недели эксперимента CD4-иммунопозитивные клетки отсутствуют.

Ключевые слова: яичники, моноклональные антитела CD4, хорионический гонадотропин.

Yalaletdinova L.R.^1, Sergeeva V.E.², Yastrebova S.A.³

¹City Hospital № 5 g Cheboksary, ² Sc.D., professor, Chuvash State University, ³Ph.D., Associate Professor, Chuvash State University

IMMUNOHISTOCHEMISTRY OF CD4 OVARY CELLS DURING LONG-TERM  EXPOSURE OF CHORIONIC GONADOTROPIN

Abstract

Immunohistochemical tests of microstructures of mice ovary in norm and  while intramuscular injection of 0,02 ml. of chorionic gonadotropin  (ChG) during 1-4 weeks have been  carried out. CD4 positive structures presence in ovaries has  been detected. Quantitate distribution of CD4 positive structures varies depending on the term of  ChG  exposure. ChG  exposure showed dose depending decrease  in CD4 cells of cortical substance of ovaries. In a week after ChG injection the quantity of CD4 cells in cortical substance  decreased  by 1.8 (see the table).  ChG exposure during two weeks resulted in substantial decrease in CD4 production in cortical substance of mice ovaries.  In medulla of ovary detection of CD4 positive structures decreases

Keywords: ovaries, monoclonal antibodies CD4, human chorionic gonadotropin.

В последние годы отмечается значительный рост патологии яичников, приводящей к нарушению менструально-овариальной и репродуктивной функций. Частота хронический воспалительных заболеваний яичников в возрасте 20-24 года увеличилась в 1,4 раз и в возрасте 25-29 лет в 1,8 раз. Последствиями воспаления являются бесплодие 10-59%, тазовый болевой синдром 24-30%, хроническая ановуляция, развитие злокачественных опухолей яичников. Отмечена роль аутоиммунных механизмов в развитии патологии яичников [6]. Нарушение иммунологической реактивности – важный фон для развития заболеваний яичников.

Внедрение современных научных методов исследований расширяют знания о механизмах развития ряда заболеваний органов репродуктивной системы [1]. В клинической практике разработаны консервативные и хирургические методы лечения разных заболеваний. Однако после лечения вследствие недостаточности иммунных реакций [2] не происходит выздоровления пациенток.

Хорионический гонадотропин (ХГ) находит широкое применение в клинической практике. Гормон позволяет пролонгировать беременность за счет иммуносупрессивного действия на иммунную систему в целом. Однако механизмы влияния ХГ на уровне яичников не изучены.

В гранулезных и тека-клетках наряду с рецепторами к нейромедиаторам существуют рецепторы к гормонам, что свидетельствует о существовании взаимосвязи нервной, эндокринной и иммунной систем [3, 4, 5].

Цель исследования: выявить и изучить состояние CD4-позитивных клеток яичников мышей при длительном действии хорионического гонадотропина.

Материал и методы.

Объектом исследования служили яичники 40 белых беспородных мышей массой 30 г. Животные были разделены на 3 группы: I – интактная группа (n=10), II – контрольная (n=10), которым внутримышечно вводили 0,02 мл физраствора, III – опытная с внутримышечным введением 0,02 мл раствора ХГ – IIIА подгруппа (n=10) введение ХГ в течение 1 недели (2 раза через каждые 3 дня), III Б подгруппа (n=10) - введение ХГ в течение 2 недель (4 раза через каждые 3 дня), III В подгруппа (n=10) - введение ХГ в течение 3 недель (6 раз через каждые 3 дня), III Г подгруппа (n=10) - введение ХГ в течение 4 недель (8 раз через каждые 3 дня). Введение препаратов проводилось с соблюдением правил асептики и антисептики. Все процедуры по уходу за мышами осуществляли согласно нормам и правилам обращения с лабораторными животными. Яичники извлекали под наркозом после завершения экспериментального воздействия.

Срезы яичников обрабатывались по стандартному протоколу: сначала подавлялась пероксидазная активность путем инкубации срезов в 3% растворе Н₂О₂ в течение 30 минут с последующей промывкой 0,1М фосфатным буфером. Для блока неспецифического связывания срезы инкубировались в течение 1 часа в 10% козьей сыворотке, после чего к ним были добавлены первые антитела к белкам CD4 на 18 часов при температуре 4 °С. В качестве вторых антител были использованы антивидовые антииммуноглобулиновые биотилированные антитела. С целью выявления биотновой метки срезы обрабатывались авидин-пероксидазным комплексом. Метод основан на высоком сродстве авидина к биотину [7]. Пероксидазную активность проявляли в инкубационной среде с диаминобензидином. В результате ферментативной реакции субстрат превращался в нерастворимый продукт коричневого цвета, совпадающий по локализации с местонахождением белка. Препараты анализировались под световым микроскопом Микмед.

Результаты исследования.

Исследованиями с применением иммуногистохимческой методики в яичниках выявлены CD4-позитивные структуры в корковом и мозговом веществе яичников. CD4 ммунопизитивными оказались гранулезные клетки. У интактных животных содержание CD4-позитивных клеток наибольшее в корковом (5±0,4 клеток в поле зрения) и в мозговом (4,6±0,1 клеток в поле зрения) веществах яичников клеток (табл). Среди гранулезных клеток также встречаются CD4-позитивные клетки.

Введение ХГ выявило дозозависимое уменьшение CD4 клеток коркового вещества яичников. Через 1 неделю после введения ХГ количество CD4 клеток в корковом веществе уменьшилось в 1,8 раз (таблица). Воздействие ХГ в течение 2 недель привело к уменьшению выработки CD4 клеток в 3,6 в сравнении с интактной группой. Длительное воздействие ХГ в течение 4 недель привело к значительному уменьшению CD4 структур в корковом веществе яичников мыши. Вероятно, при введении ХГ происходят процессы угнетения клеточного иммунитета.

В мозговом веществе яичников снижается выявляемость CD4 структур в через 1 неделю в 1,8 раз.

Среди гранулезных клеток значительно снижается количество CD4 клеток. Если у животных интактной группы регистрируется одна CD4-позитивная клетка в поле зрения, то при введении ХГ в течение 4 недель мы не обнаружили CD4-позитивных структур.

Таблица Количественное распределение CD4-позитивных структур в яичниках у интактных, контрольных и экспериментальных мышей с введение ХГ (M±m)

Структуры	Группы животных
	I группа	II группа	III группа
			III A	III Б	III B	III Г
Корковое вещество	5±0,4	0,6±0,003	1,8±0,009	1,4±0,02	1±0,002	0,8±0,001*
Мозговое вещество	4,6±0,1	4,2±0,5	2,6±0,1	3,2±0,5	3,4±0,3	4±0,3
Гранулезные клетки	1±0,06	0,6±0,006	0,2±0,04	0,2±0,008	-	-
Фолликулярная жидкость	1±0,05	1,4±0,1	-	0,4±0,003	0,6±0,008	1±0,2

Примечание. *р<0,05 по сравнению с I группой.

При ведении ХГ в течение 1 недели  мышам количество CD4-позитивных клеток в корковом веществе снижается в 2,8 раз и достигает значений 1,8±0,009 клеток в поле зрения. У животных контрольной группы отмечено снижение количества CD4-позитивных клеток в корковом веществе яичников в 8,3 раза, мозговом  веществе в 1,1 раза.

В III Б подгруппе мышей продолжает снижаться число CD4-позитивных клеток во всех структурах яичников. При сравнении с данными контрольной группы снижено количество клеток в корковом веществе в 3,6 раз, в мозговом веществе в 1,4 раз. Снижено количество CD4-позитивных гранулезных клеток в 5 раз (табл.).

Обсуждение результатов.

Выявлен CD4 фенотип клеток яичника мышей в норме и при длительном воздействии ХГ. Наши результаты согласуются с данными ряда авторов о наличии иммунокомпетентных структур в яичниках.

Установлена связь клеток яичника с фенотипом CD4 с гормональными процессами.

Изменение количественного распределения CD4 структур в яичнике отражает структурную реорганизацию при воздействии ХГ, а, следовательно, указывает на участие гормона в нейроэндокринной функции яичников и фолликулогенезе.

Проведенное исследование демонстрирует изменение популяции CD4 структур в яичнике при гормональном воздействии. Изменение содержания CD4 – позитивных структур при различных сроках воздействия ХГ свидетельствует о необходимости выработки дифференцированного подхода в терапии патологии яичников. Наличие CD4-иммунокомпетентных микроструктур указывает на наличие клеточно-опосредованных иммунологических процессов в яичниках.