СИНДРОМ БЕЛОГО ПЯТНА У КРЕВЕТОК (WSD). ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ВОДЫ НА АКТИВНОСТЬ ВИРУСА. ИСПЫТАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ ВАКЦИНЫ

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.120.6.037

СИНДРОМ БЕЛОГО ПЯТНА У КРЕВЕТОК (WSD). ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ВОДЫ НА АКТИВНОСТЬ ВИРУСА. ИСПЫТАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ ВАКЦИНЫ

Научная статья

Хатиб Я.^1,*, Макаров В.В.²

¹ORCID: 0000-0003-4326-0462;

²ORCID: 0000-0002-8464-6380;

^{1, 2}Российский университет дружбы народов, Москва, Россия

* Корреспондирующий автор(yazedkhatib[at]hotmail.com)

Аннотация

В статье рассматривается синдром белого пятна креветок WSD, вызываемый двуцепочечным ДНК-вирусом семейства Nimaviridae рода Whispovirus, WSSV. Этот вид вируса вызывает повсеместные вспышки данного заболевания, наносящего огромный экономический ущерб хозяйствам по разведению креветок. Попадая в организм, вирус ассоциируется в тканях экто– и мезодермального происхождения, провоцируя возникновение покраснений под хитиновым покровом тела, а затем образование белых пятен по самому покрову. В случае возникновения эпидемии смертность ракообразных составляет 100%. Представляется необходимым изучить возможные способы лечения и профилактики распространения данного вируса для обеспечения полного функционирования креветочных ферм и снижения экономических потерь для производителя.

Ключевые слова: синдром белого пятна, креветка, вирусные болезни ракообразных, Whispovirus, WSD.

WHITE SPOT DISEASE IN SHRIMP (WSD).INFLUENCE OF WATER TEMPERATURE ON VIRUS ACTIVITY.VACCINE DEVELOPMENT TRIALS

Research article

Hatib Yazid^1, *, Makarov V.V.²

¹ORCID: 0000-0003-4326-0462;

²ORCID: 0000-0002-8464-6380;

^{1, 2}Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, Russia

*Corresponding author(yazedkhatib[at]hotmail.com)

Abstract

The article studies the white spot disease in shrimp WSD, caused by the double-stranded DNA virus of the Nimaviridae family of the Whispovirus genus, WSSV. This type of virus causes widespread outbreaks of the disease, leading to enormous economic damage to shrimp farming. Once in the body, the virus manifests in the tissues of ectodermal and mesodermic origin, causing redness under the chitin cover of the integument, and white spots on the cover itself. In the event of an epidemic, the mortality of crustaceans would be 100%. It deems to be necessary to study treatment and prevention of the virus spread in order to ensure the full functioning of shrimp farms and to reduce the economic losses to the farmer.

Keywords: white spot disease, shrimp, viral diseases of crustaceans, Whispovirus, WSD.

Введение

Выращивание креветок является во многих странах одним из основных экономических ресурсов. Доля производства креветок в рыбном промысле по миру составляет около 25%. C 2015 по 2020 год основные производящие регионы (Индия, Китай, Северная и Южная Америка, Азия) показали стойкое увеличение производства креветок от 6,0% до 19,4% и самый высокий рост наблюдается в Южной Америке – рост показателя составил от 11,4% до 23,0% [1].

Синдром белого пятна у креветок впервые был диагностирован в 1992 году в Тайване. Затем эпидемия переместилась в Китай, а в 1993 году вирусом были поражены креветки на японском и южнокорейском побережьях. К 1996 году тотальный экономический ущерб был нанесен хозяйствам Восточной Азии, несколько креветочных ферм были полностью уничтожены (см. рисунок 1). В конце XX века вспышки WSD были зарегистрированы в США и Южной Америке, а затем в Океании. В 2016 году проявление вируса было отмечено в Австралии [2].

Рис. 1 – Иллюстрирование экономических потерь от WSD 1991-2013 гг.

Отметим, что Вирионы вируса рода Whispovirus состоят из оболочки, нуклеокапсида и придатков. Капсид вируса окутан триламинарной свободно прилегающей оболочкой. Вирионы яйцевидны, или бациллиформны до эллипсоида, имеют выступы, которые проходят через оболочку и имеют нитевидное или хвостообразное полярное расширение на одном конце. Диаметр вирионов составляет 120-150 нм, длина-270-290 нм. Капсид удлиненный и проявляет правильную симметрию. Нуклеокапсид имеет палочковидную форму. Вирус очень вирулентен и вызывает гибель 100% аквакультуры при попадании в воду. Среди восприимчивых организмов вирус чаще всего поражает креветок семейства Penaeidae.

Вспышки WSD известны у следующих видов:

• Креветка черная тигровая (Penaeusmonodon);
• Китайская белая креветка (Penaeuschinensis);
• Банановая креветка (Penaeus merguiensis);
• Индийская белая креветка (Penaeusindicus);
• Японская тигровая креветка (Penaeusjaponicus);
• Тихоокеанская белая креветка (Penaeusvannamei);
• Креветка голубая тигровая (Penaeusstylirostris);
• Зеленая тигровая креветка (Penaeussemisulcatus);
• Гигантская пресноводная креветка (Macrobrachiumrosenbergii).

Основная часть. Вспышка данного заболевания может быть сформирована многими факторами изменения окружающей среды. Стрессовые факторы, а также остатки химических средств и инсектицидов, соли тяжелых металлов из сточных вод, изменения температуры воды из-за антропогенного воздействия или природных факторов также могут способствовать активации вируса WSD [3].

Для того чтобы проверить, насколько влияют факторы окружающей среды (температура воды) на инфекционность вируса, учеными были проведены 2 эксперимента[7].

В первом эксперименте были отобраны 4 группы креветок, первую и вторую группы заразили вирусом уколом внутримышечно, креветок первой группы оставили в воде, температура которой составляла 24 °C, а креветок второй группы – в воде с температурой 32 °С, остальные две группы были оставлены для контроля. Креветки были здоровые, одну из этих групп поместили в воде с температурой 24 С°, а вторую – в воде с температурой 32С°. На 12-ый день температуру у второй группы снизили с 32 С° до 24 С°.

От этого эксперимента были получены следующие результаты: в течение 20 дней креветки групп контроля все остались живыми, креветки первой группы погибли все на шестой день, а креветки второй группы остались живыми до 12-ого дня, потом до снижения температуры и после ее снижения смертность постепенно достигла до 100% на 19-ый день (см. рисунок 2).

Рис. 2 – Влияние температуры воды на инфекционность вируса

Далее был проведен второй эксперимент, при котором заразили креветок двумя разными путями. Этот эксперимент состоял из 6 групп креветок, первую и вторую группы кололи вирусом внутримышечно и поместили в воду с температурой 32 С° и с температурой 26 С° соответственно. Третью и четвертую группы заразили пероральным путем (peros) через еду. Третья группа находилась в воде, температура которой составляла 32 С°, четвертая группа – в воде температурой 26 С°. Пятую группу кололи препаратом Инокулюмом, эта группа животных сначала оставалась в воде при нормальной температуре, которую затем повышали до 33 С° на 1 час в день. А Шестая группа была группой контроля, кололи креветок этой группы физическим раствором NaCl и оставили в воде с температурой 26 С°.

В конце этого эксперимента были получены следующие результаты: в первой группе выживаемость достигла 95%, во второй группе все креветки погибли на 8-ой день эксперимента, креветки третьей группы выжили все, а креветки четвёртой группы погибли на 15-ый день, на 9-ый день креветки 5-ой группы также погибли. Контрольная группа креветок осталась живой полностью (см. рисунок 3).

Рис. 3 – Влияние температуры воды на инфекционность вируса при разных путях заражения креветок

По результатам этих экспериментов отмечается, что при температуре 24–26° экспоненциальный рост вирулентности вируса и процент заражения в течение суток составляет 100%. Получены результаты, которые представлены в графиках (см. рисунок 2, 3) подтверждают тот факт, что снижение температуры воды является стрессовым фактором для ракообразных и влечет за собой рост вирулентности вируса и увеличение числа заболевших креветок.

Также с помощью этих экспериментов обнаружили, что при температурах выше 32 °CWSD не развивается у инфицированного WSSV креветок. Однако, когда те же креветки были охлаждены до 26 °C и ниже, болезнь быстро развивалась со 100% смертностью. Это значит, что репликация WSSV значительно снижается или прекращается в гипертермических условиях.

На сегодняшний день не существует зарегистрированной эффективной вакцины от WSD, но разработчики из разных стран мира плодотворно занимаются данным вопросом. Разработка методов диагностики и терапии синдрома белых пятен у креветок плотно ведется в Океанском университете Китая и Исследовательском рыбохозяйственном институте Желтого моря г. Циндао [6].

Одним из наиболее перспективных методов профилактики WSD является разработка рекомбинантного лизоцима: вирусная инфекция креветок стимулирует экспрессию гена лизоцима, а внутримышечная инъекция рекомбинантного белка, идентичного лизоциму креветок, увеличивает устойчивость этих ракообразных к заражению вирусом синдрома белого пятна (WSD) [4].

Компанией CPF, Таиланд разработан препарат Semvac-P, который служит средством профилактики синдрома белых пятен. Наилучший эффект определяется скармливанием препарата на всем протяжении развития аквакультуры и позволяет сократить вероятность возникновения WSD до 80% [5].

По данным журнала Fish&ShellfishImmunology, сибирские ученые и их мексиканские коллеги разработали лекарство с наночастицами серебра, которое может стать для аквакультуры спасением от WSD. Основной из задач, по мнению авторов исследования, является оптимизация метода массовой обработки креветок, поскольку работать с каждой по отдельности неэффективно. Также разрабатываются несколько способов использования препарата, особенно с водой и кормом.

При разработке лечебного-профилактического препарата от WSD проводилась оценка титрования вируса в теле креветок для того, чтобы узнать летальную дозу вируса и выбрать дозу для эксперимента. Результаты отражены на схеме (см. рисунок 4) [8].

Рис. 4 – Титрование вируса WSSV в клетках эпидермиса креветок

Следует отметить, что при титре вируса 1х10² наблюдается достижение 100% заболевания у популяции гораздо стремительнее, чем при титре 1х10⁴, а точнее на вторые сутки, в то время как при титре 1х10⁴, отмечается достижение 100% заболевших организмов на 8 сутки. При титре 1х10⁵ максимальный процент заболевших креветок в популяции составил 60%. При титре вируса 1х10³ болезнь во всей популяции регистрировали на 4 сутки. Наиболее результативным для эксперимента является титр вируса 1х10⁴. Можно сделать вывод, что с ростом титра вируса болезнь развивается менее стремительно, что обусловливается активацией иммунной системы ракообразных в ответ на возрастающую вирулентность вирусных частиц.

Испытания вакцины от WSD продолжаются по настоящее время. Группой ученых разработан препарат, позволяющий уберечь популяцию от проявления WSD. Получены достоверные результаты по снижению уровня заболевших креветок в водных условиях.

Так, например, креветкам вводили два типа вакцин (внутримышечную и пероральную), название которым было дано по специфическим структурным белкам VP446 и VP19 с титром вируса 1х10⁴, и еще при каждом типе введения этой белковой вакцинации двум контрольным группам – одна была отрицательной, то есть без заражения и без введения вакцины, и положительная – с заражением, но тоже без вакцины. Исследования продолжались в течение 2 недель. Отмечается, что в позитивной контрольной группе, зараженной WSD без введения вакцины (голубого цвета на рисунке 5), максимальный уровень заболевших креветок достигается на 8 день, летальность составляет 100% (см. рисунок 5) [8].

При испытании вакцин VP446 и VP19 внутримышечно в двух опытных группах наблюдается рост числа заболевших креветок с проявлениями WSD до 8 дня, затем уровень распространения инфекции выходит на плато (красные и зеленые курсивы на рисунке 5). Процент зараженных креветок представляет возможным сделать вывод об эффективности применения данной вакцины для остановки уровня заболевания в исследуемой популяции, что позволит сократить экономический ущерб для креветочных хозяйств стран Азии и Америки, у которых промысел рыбопродуктов является экономически важным промыслом для полноценного существования ряда прибрежных государств Южного полушария [8].

Рис. 5 – Испытания инъекционной вакцины от WSD

На рисунке 6 четко отслеживается положительная тенденция применения вакцин от ДНК-содержащего вируса семейства Nimaviridae пероральным путем, к вакцинам был добавлен полный адъювант Фрейнда (FCA) для предотвращения диспергирования рекомбинантных белков в воде. Отмечается выход на плато к 12 дню, уровень распространения инфекции в группе, где испытывали VP19, останавливается на показателе 50,2%, в группе VP446 также на 12-ый день выходит на плато, но на показателе в 89,2%. Это свидетельствует о том, что вакцина VP19 гораздо более эффективна, чем ее аналог при пероральным введении. И еще можно отметить что внутримышечное введение белковой вакцины более эффективно, чем пероральное. В обеих отрицательных группах летальность составила 0%, а в положительных – 100% (см. рисунок 6).

Рис. 6 – Испытания двух типов вакцин от WSD

Результаты этого эксперимента показывают, что защита от WSSV может быть создана в самих креветках, используя вирусный структурный белок в качестве белковой вакцины, потому что представляется возможным использовать одну из разработанных вакцин (после проведения ряда клинических испытаний) как средство профилактики и лечения WSD у креветок и ракообразных. Разработка данной вакцины станет перспективным шагом в фармацевтической промышленности, так как проявления синдрома белого пятна у ракообразных вызывают гибель 100% и наносят непоправимые потери креветочным хозяйствам по всему миру.

Заключение

Вируссемейства Nimaviridae рода Whispovirus вызывает синдром белого пятна у креветок и ряда ракообразных (в т.ч. пресноводных раков и крупных крабов). Симптоматика заключается в первичном покраснении эпидермиса под хитиновым покровом, а затем проявление белых пятен (d=2-3 мм) по панцирю. Вирус крайне вирулентен и вызывает гибель 100% популяции при возникновении в промышленных хозяйствах. Вспышки данного заболевания встречаются повсеместно и наносят огромный экономический ущерб ряду стран. Представляется необходимым вопрос разработки комплексной вакцины от WSD для профилактики и лечения синдрома белого пятна. На сегодняшний день имеются достоверные результаты испытаний ряда вакцин от WSD, которые после прохождения ряда испытаний могут занять определенную нишу в фармацевтической промышленности как первый общеизвестный препарат от синдрома белого пятна креветок. Также можно использовать влияние гипертермии на инфекционность вируса, чтобы избежать 100%-ой смерти креветок, пока нет 100%-ой разработанной вакцины.

 

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

 

Список литературы / References

1. Зимин А.А.Экономика аквакультуры гигантских креветок и роль бактериальных инфекций / А.А.Зимин, Н.А. Никулин, Я.Цунги и др. // Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. – 2019. – Т. 8. – №2. – С. 187–192.
2. Буторина Т. Е. Болезни и паразиты культивируемых и промысловых беспозвоночных и водорослей/ Т.Е. Буторина, В.Н. Кулепанов, Л.В. Зверева. – Санкт-Петербург: Лань, 2018. – 124 с.
3. Калюжин О.В. Антибактериальные, противогрибковые, противовирусные и иммуномодулирующие эффекты лизоцима: от механизмов к фармакологическому применению/ О.В. Калюжин// Эффективная фармакотерапия. – 2018. – №14. – С. 6–13.
4. Кондратьева И.А.Аквакультура КНР И России: научные центры по изучению патологии рыб и других объектов/ И.А.Кондратьева, М.Е.Маклакова, Г.Ляньсин // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. – 2010. – № – С. 34–40.
5. Лагуткина Л.Ю.Основные аспекты деятельности тайской компанииCPF – лидера аквакультуры по выращиванию креветок/ Л.Ю.Лагуткина, С.В.Пономарёв, Ю.В.Фёдоровых // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия: Рыбное хозяйство. – 2013. – №1. – С. 167–172.
6. Mai W.J.Protection of blue shrimp (Litopenaeus stylirostris) against the White Spot Syndrome Virus (WSSV) when injected with shrimp lysozyme / W.J.Mai, W.N.Wang // Fish Shellfish Immunol. – 2010. – Vol.28. – №4. – P.727–733.
7. -H., Effect of hyperthermia on the replication of white spot syndrome virus (WSSV) in Procambarus clarkia / H.-H. Du // DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS. – 2006. – Vol. 71. –Pp. 175–178.
8. Ha Y.-M. Vaccination of Shrimp (Penaeus chinensis) against White Spot Syndrome Virus (WSSV) / Y.-M. Ha // Microbiol. Biotechnol.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Zimin A.A. Ekonomika akvakul'tury gigantskih krevetok i rol' bakterial'nyh infekcij [Aquaculture economics of colossal shrimp and the role of bacterial infections] / A.A. Zimin, N.A. Nikulin, Ya. Tsungi et al. // Sbornik nauchnyh trudov Krasnodarskogo nauchnogo centra po zootekhnii i veterinarii [Collection of scientific papers of Krasnodar Scientific Center for Zootechnics and Veterinary Sciences]. – 2019. – Vol. 8. – №2. – P. 187–192. [in Russian]
2. Butorina T.E. Bolezni i parazity kul'tiviruemyh i promyslovyh bespozvonochnyh i vodoroslej [Diseases and parasites of cultivated and commercial invertebrates and algae] / T.E. Butorina, V.N. Kulepanov, L.V. Zvereva. / – Saint Petersburg: Lan' publishing house, 2018. – 124 p. [in Russian]
3. Kalyuzhin O.V. Antibakterial'nye, protivogribkovye, protivovirusnye i immunomoduliruyushchie effekty lizocima: ot mekhanizmov k farmakologicheskomu primeneniyu [Antibacterial, antifungal, antiviral and immunomodulatory effects of lysozyme: from mechanisms to pharmacological application] / O.V. Kalyuzhin // Effektivnaya farmakoterapiya [Effective pharmacotherapy]. – 2018. – №14. – P. 6–13. [in Russian]
4. Kondrat'eva I.A Akvakul'tura KNR I Rossii: nauchnye centry po izucheniyu patologii ryb i drugih ob"ektov [Aquaculture of PRC and Russia: scientific centers for the study of pathology of fish and other objects] / I.A. Kondrat'eva, M.E. Maklakova, G.Lianxing // Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16: Biologiya [Bulletin of Moscow State University. Series 16: Biology]. – 2010. – №3. – P. 34–40.[in Russian]
5. Lagutkina L.Y. Osnovnye aspekty deyatel'nosti tajskoj kompanii CPF – lidera akvakul'tury po vyrashchivaniyu krevetok [The main activities of the Thai company CPF – the leader of aquaculture in the shrimp cultivation] / L.Y. Lagutkina, S.V. Ponomaryov, Yu.V. Fyodorovyh // Vestnik Astrahanskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo universiteta. Seriya: Rybnoe hozyajstvo [Bulletin of Astrakhan State Technical University. Series: Fishery]. – 2013. – №1. – P. 167–172. [in Russian]
6. Mai W.J.Protection ofblue shrimp (Litopenaeus stylirostris) against the White Spot Syndrome Virus (WSSV) when injected with shrimp lysozyme / W.J.Mai, W.N.Wang // Fish Shellfish Immunol. – 2010. – Vol.28. – №4. – P.727–733.
7. -H., Effect of hyperthermia on the replication of white spot syndrome virus (WSSV) in Procambarus clarkia / H.-H. Du // DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS. – 2006. – Vol. 71. –Pp. 175–178.
8. Ha Y.-M. Vaccination of Shrimp (Penaeus chinensis) against White Spot Syndrome Virus (WSSV) / Y.-M. Ha // Microbiol. Biotechnol.