ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ВЫРАЖЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.120.6.032

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ВЫРАЖЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Научная статья

Гаппоева В.С.¹, Гаглоева А.Р.², Хабаева З.Г.^3, *

¹ORCID: 0000-0002-3127-4122;

³ORCID: 0000-0001-7214-7827;

^{1, 2, 3}Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова, Владикавказ, Россия

* Корреспондирующий автор(zinahabaeva[at]mail.ru)

Аннотация

К числу доклинических исследований соединений синтетического или естественного происхождения относятся методы оценки токсичности, тератогенности, мутагенности, аллергенности и т.д. Такого рода работы необходимы для оценки возможности или невозможности использования данных препаратов в соответствии с особенностями их функциональной направленности. Оценка острой токсичности относится к категории первоочередных задач. В работе использованы две тест-системы (беспозвоночные ракообразные и млекопитающие):DaphniamagnaStraus и белые нелинейные лабораторные крысы (самки). Проведены исследования, направленные на изучения наличия острой токсичности у синтетических препаратов гетероциклической природы (изоксазолов и 8-оксихинолинов). Выявлены соединения с разной степенью выраженности токсического действия. Соединения с низкой токсичности использовали на крысах. Проведенные исследования не выявили гибели среди подопытных животных.

Ключевые слова: острая токсичность, тест-система дафнии, крысы, гетероциклические соединения.

ASSESSMENT OF SYNTHETICALLY ACTIVE CHEMICAL COMPOUNDS TOXICITY

Research article

Gappoeva V.S¹., Gagloeva A.R²., Habaeva Z.G^3, *.,

¹ORCID: 0000-0002-3127-4122;

³ORCID: 0000-0001-7214-7827;

^{1, 2, 3}North Ossetian State University after K.L. Khetagurov, Vladikavkaz, Russia

*Corresponding author(zinahabaeva[at]mail.ru)

Abstract

Pre-clinical research of compounds of synthetic or natural origin include methods for assessing toxicity, teratogenity, mutagenicity, allergenicity, etc. This type of study is necessary to assess the possibility or impossibility of using these drugs in accordance with the specifics of their functional scope. Acute toxicity assessment is prioritized. Two test systems (invertebrate crustaceans and mammals) were used: Daphnia magna Straus and white nonlinear laboratory rats (females). Research aimed at studying acute toxicity presence in synthetic drugs of heteronuclear nature (isoxazols and 8-oxyquinolines) has been conducted. Compounds with various degrees of toxicity have been identified.  Compounds with hypotoxicity were used on rats. The conducted research has not revealed deaths among test animals.

Keywords: acute toxicity, Daphnia test-system, rats, heterocyclic compounds.

Введение

Одной из центральных задач в процессе синтеза химических соединений с выраженной биологической активностью является проведение доклинических исследований, которые включают оценку веществ на тератогенность, мутагенность, аллергенность, токсичность [1]. Правила доклинических исследований определены и запротоколированы в Федеральном законе «Об обращении лекарственных средствах»; сюда входит определение у синтезированных препаратов токсичности [2]. Существуют различные подходы оценки токсичности вещества, нередко определяемые функциональными свойствами тестируемых веществ, характером их биологической активности [1], [3], [4].

Методы оценки токсичности, предполагающие использование различных функциональных подходов и основанные на применении физиологических, микробиологических, физико-химических и др. методов регламентируют использование оценки вещества в условиях острого и хронического эксперимента на разных биологических моделях [5]. Такой подход определяет возможность решения нескольких задач, включая выбраковку тестируемых веществ на стадии острого эксперимента, что существенно снижает любые затраты, в том числе и временные; учет возможности кумулирующего эффекта токсичности препарата в условиях insity; оценку особенностей действующего вещества на уровне одноклеточных и многоклеточных организмов.

Материл и методы исследования

В настоящей работе осуществляли анализ токсичности синтетических соединений гетероциклической природы с выраженной биологической активностью. Известно, что данный класс химических веществ характеризуется широкой представленностью как среди естественных биологически активных веществ, включая гормоны, аминокислоты, ферменты, так и искусственных, в том числе синтетических антибиотиков. Изоксазолы и оксихинолины – вещества с разным спектром действия, являются по своей химической структуре гетероциклами, проявляющими специфическую биологическую активность. 8-оксихинолины являются гетероциклическими соединениями, используемыми в качестве наружных косметологических средств, антисептиков, дезинфицирующих средств и т.д. Изоксазолы проявляют более разнонаправленную биологическую активность[6], [7], [8].

Оценку токсичности осуществляли у 10 препаратов из группы 8-оксихинолинов и 5 препаратов из группы изоксазолов. Предварительно, у этих соединений была обнаружена разной степени выраженность и разнонаправленность биологической активности. Возможность последующего использования и изучения данных веществ напрямую связаны с отсутствием у них токсичности.

Для оценки наличия или отсутствия токсичности у синтезированных соединений были использованы две тест-системы, хорошо зарекомендовавшие себя в доклинических исследованиях, обладающие высокой валидностью и широко используемые в практике диагностической токсикологии. Токсичность определяли в условиях острого эксперимента на беспозвоночных и позвоночных животных. Известно, что многие метаболические, регуляторные, адаптивные реакции млекопитающих наиболее близки по своей реализации и закономерностям ответным реакциям человека. Отсюда необходимость тестирования на высших животных. В то же время сама процедура эксперимента с млекопитающими, ее продолжительность, необходимость щадящего отношения к животным обуславливают необходимость предварительного тестирования веществ на наличие или отсутствие токсичности на беспозвоночных.

Для оценки острого токсического действия тестируемых веществ на беспозвоночных животных определяли летальную дозу, т.е. количества вещества, приводящее к смерти при 48-часовой экспозиции. С этой целью рассчитывали летальную (ЛК) и безопасную (БК) концентрацию: ЛК _100-48 (гибель 100% животных), ЛК_50-48 (гибель 50%) БК_10-48 (гибель 10%) БК_0-48 (отсутствие погибших). После 48-часовой экспозиции действующего вещества отмечали количество погибших особей в контрольной и опытной группах и рассчитывали коэффициент токсичности по формуле:

,

где Х_к – количество выживших в контроле; Х_о – количество выживших в опыте.

Для определения токсичности тестируемых веществ на млекопитающих были использованы белые нелинейные крысы с фиксированным весом.

Оценку острой токсичности осуществляли на низших ракообразных -DaphniamagnaStraus [9], [10] и на белых нелинейных лабораторных крысах. При использовании тест-системы DaphniamagnaStraus были выполнены все предварительные установки, регламентируемые при работе с ними, что позволило использовать генетически однородную популяцию животных. В последующим также были соблюдены условия освещенности, кормления, температурного режима, состояние среды обитания, возраст в начале тестирования не более 24 часов и т.д. В чистые пробирки помещали по 15 рачков и пипеткой вводили тестируемое вещество с определенной концентрацией. В качестве контроля использовали аналогичную группу животных, содержащихся в обычных условиях. Оценивали согласно Госту 2 параметра: полуэффективную концентрацию и иммобилизацию.

В соответствии с методикой оценку состояния жизнеспособности животных осуществляли 2 раза: после 24 и 48 часовой экспозиции тестируемого вещества. В первом случае (24 часовое воздействие экспериментального вещества) опытные животные по своим физиологическим и поведенческим реакциям не отличались от контрольных, они активно плавали, демонстрируя высокую жизнеспособность; погибших особей не было. Первоначально для всех тестируемых веществ рассчитывали % погибших особей при разной концентрации используемых веществ (таблица 1).

Таблица 1 – Выживаемость дафний через 48 часов экспозиции в растворах исследуемых соединений

№	Шифр соединения	Показатель гибели дафний А, %									Контроль
		Концентрация соединений, мкг/мл
		1000	500	250	125	60,2	30,1	15,6	7,5	3,2	0
1	Изок-1	80	50	10	10	0	0	0	0	0	0
2	Изок-2	80	40	10	10	0	0	0	0	0	0
3	Изок-3	80	50	10	10	10	0	0	0	0	0
4	Изок-4	100	70	40	20	20	10	0	0	0	0
5	Изок-5	100	70	40	20	10	10	0	0	0	0
6	Ок-1	100	100	100	100	100	100	100	100	100	0
7	Ок-2	100	80	20	20	20	10	0	0	0	0
8	Ок-3	100	90	40	40	40	40	40	40	20	0
9	Ок-4	100	80	20	20	20	20	20	20	20	0
10	Ок-5	100	100	100	100	100	100	100	100	20	0
11	Ок-6	100	100	100	100	100	100	100	100	40	0
12	Ок-7	100	100	100	100	100	100	100	100	20	0
13	Ок-8	100	100	100	100	100	100	100	100	20	0
14	Ок-9	100	100	100	100	100	100	100	100	20	0
15	Ок-10	100	100	100	100	100	100	100	100	20	0

Результаты оценки процента погибших особей позволили рассчитать показатели острой токсичности для этих веществ по показателям летальной (табл.2)

Таблица 2 – Показатели острой токсичности исследуемых соединений при использовании в качестве тест-объектов DaphniamagnaStraus

№	Шифр соединения	ЛК100-48	ЛК50-48	БК50-48	БК0-48
1	Изок-1	1000	500	125-250	3,2 до 6,2
2	Изок-2	1000	500	125-250	3,2 до 6,2
3	Изок-3	1000	500	125-250	3,2 до 6,2
4	Изок-4	1000	500	15,6-30,1	3,2 до 7,5
5	Изок-5	1000	500	15,6-30,1	3,2 до 7,5

Окончание таблицы 2 – Показатели острой токсичности исследуемых соединений при использовании в качестве тест-объектов DaphniamagnaStraus

№	Шифр соединения	ЛК100-48	ЛК50-48	БК50-48	БК0-48
6	Ок-1	125-1000	500	-	-
7	Ок-2	1000	500	15,6-30,1	3,2 до 15,6
8	Ок-3	1000	500	-	-
9	Ок-4	1000	500	-	-
10	Ок-5	125-1000	-	-	-
11	Ок-6	125-1000	-	-	-
12	Ок-7	125-1000	-	-	-
13	Ок-8	125-1000	-	-	-
14	Ок-9	125-1000	-	-	-
15	Ок-10	125-1000	-	-	-

Примечание: ЛК _100-48 – летальная токсичность; ЛК_50-48 – средняя летальная токсичность;БК_10-48- минимальная летальная токсичность;БК_0-48 – безвредное вещество

Проведенные исследования позволили выявить вещества – (1) высокотоксичные: 8 оксихинолинат титана (IV), 8 оксихинолинат олова, 8 оксихинолинат германия; (2) малотоксичные: 8 оксихинолинат железа, 4-амино-5-бензилизоксазол), 1,1-бутан-1,4- диблис (2,2-дихлорциклопропан) и (3) нетоксичные: 1,1-дихлорбензилциклопропан, 1,1-дихлорфенилциклопропан, 3-хлор-5-метилизоксазол.

В качестве контроля состояния жизнеспособности биосистемы были использованы сухие штаммы фабричных дрожжей (Saccharomycescerevisiaе), что обеспечивало отсутствие каких-либо посторонних примесей. Готовые суспензии дрожжей добавляли в популяцию дафний в соответствующих концентрациях инкубировали в течение 48 часов и смотрели результаты соответственно через 24 и 48 часов. Как через 24, так и через 48 часов во всех пробирках дафнии все оставались живыми, у них не проявлялись какие-либо физиологические нарушения или отклонения в поведении.

Исследования на крысах продолжались в течение 14 дней; на протяжении первых 5 дней животным внутрибрюшинно вводили тестируемое вещество (хлор-5-метилизоксазол) в количестве 0,02 мг на кг веса. В работе использованы только самки, которые, как известно, обладают повышенной чувствительностью к токсическим веществам по отношению к самцам. Оценивали внешний вид, массу и поведенческие характеристики животных. В качестве контроля были использованы животные, которым аналогичным образом вводили физиологический раствор. Проведенные исследования показали отсутствие каких-либо изменений в состоянии животных: вес тела, внешний вид, поведенческие реакции животных не менялись.

Результаты исследований позволяют сделать следующие выводы.Соединение 3-хлор-5-метилизоксазол, токсичность которого проверяли в остром эксперименте на белых лабораторных крысах, также показало ее отсутствие. Проведенные исследования наглядно продемонстрировали положение о необходимости предварительного использования беспозвоночных в качестве тест-систем для определения токсичности с целью уменьшения количества используемых в дальнейшем млекопитающих[5].Среди протестированных веществ с использованием тест-системыDaphniamagnaStraus выделены соединения с высокой острой летальностью, малочувствительные и нетоксичные.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Alabaster V. In Vivo Pharmacology Training Group. The fall and rise of in vivo pharmacology: In vivo pharmacology training group / V. Alabaster // Trends Pharmacol. – 2002. – №23: – Pp. 13–8.
2. On the circulation of medicines: Federal Law of April 12, 2010. – N 61-FZ
3. Parasuraman S. Toxicological screening / S.Parasuraman// J Pharmacol Pharmacother serial online 2011. – Oct. 12. – 2013 – Pp. 74–9.
4. Waller W.T. Acute and Chronic Toxicity / W.T. Waller, H.J. Allen //Encyclopedia of Ecology – 2008. – Pp. 32–43.
5. Nechaeva O.V.Study of the toxicity of heterocyclic compounds with high antimicrobial activity / O.V. Nechaeva, N.F. Shurshalova, E.I. Tikhomirova et al. // Experimental and Clinical Pharmacology – 2016. – № 79(8). – Pp. 29-32.
6. Galenko A.V.Recent advances in the chemistry of isoxazole / A.V. Galenko, A.F. Khlebnikov, M.S. Novikov et al. //Advances in Chemistry. – 2015. – Vol. 84. – № 4. –Pp. 335–377.
7. Dyadyuchenko L.V.Synthesis of substituted isoxazolo[5,4-b]pyridines and their antidote activity / L.V. Dyadyuchenko, I.G. Dmitrieva, V.S. Zavodnov et al. // Scientific journal of KubSAU. – 2016. – №. 122. – Pp.471–480.
8. Gubina T.I.Determining the nature of the biological action of new polyheterocyclic compounds on plants and assessing the environmental safety of their use / T.I. Gubina, A.A. Ukhova, S.V. Isaeva et al //. Izv. Sarat. University. Chemistry. Biology. Ecology. – 2017. – №3. – Pp.267–273
9. Guilhermino L.Acute toxicity test with Daphnia magna:an alternative to mammals in the prescreening of chemical toxicity Ecotoxicol / L. Guilhermino, T. Diamantino, M.C. Silva, et al. // Environ. Saf. – 2000. – № 46(3). – 357–362.
10. Mashchenko Z.E. Study of ampicillin toxicity to daphnia magna crustaceans and activated silt community / Z.E. Mashchenko, E.V. Maslova, P.G. Mizina et al. // Toxicological Review. – 2018. – № 1. – Pp. 30–34.