ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФЕРМЕНТА ДЕКСТРАНАЗЫ НА ОСНОВЕ SACCHAROMYCES CEREVISIAE В СВЕКЛОСАХАРНОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФЕРМЕНТА ДЕКСТРАНАЗЫ НА ОСНОВЕ SACCHAROMYCES CEREVISIAE В СВЕКЛОСАХАРНОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

Научная статья

Карпова Н.Н.^1, *, Могилевская И.В.², Семенова О.Ю.³, Колотова О.В.⁴, Супрунюк А.С.⁵, Зибаров Е.В.⁶, Кравченко Т.В.⁷

⁴ ORCID: 0000-0002-2206-2822;

^1-7 Волгоградский государственный технический университет, Волгоград, Россия

* Корреспондирующий автор (karpovand9799[at]mail.ru)

Аннотация

В данной статье проанализированы методы получения фермента декстраназа. Рассмотрены основные проблемы свеклосахарного производства, связанные с воздействием штамма Leuconostoc mesenteroides на свойства получаемого свекловичного сока в ходе технологического процесса. Рассмотрены способы получения фермента с использованием различных микроорганизмов. Составлена сравнительная характеристика источников получения фермента. Основными достоинствами использования дрожжей в культивировании декстраназы являются сохранение их ферментативной активности и большая скорость роста по сравнению с грибными культурами. Определены необходимые компоненты, способствующие приросту биомассы штамма Saccharomyces cerevisiae Y-1531. Получены количественные характеристики добавок для оптимального состава среды для культивирования. По результатам экспериментальных исследований оптимальными добавками для исследуемого штамма являются магний в концентрации (0,06 %), цинк в концентрации (0,01 %), кальций (0,02 %), янтарнокислый натрий (0,005 %) и витамин В1 в концентрации (0,04 %).

Ключевые слова: фермент декстраназа, дрожжи, сахарная свекла, ферментативный гидролиз, свеклосахарное производство, микроэлементы.

ADVANTAGES OF USING THE DEXTRANASE ENZYME BASED ON SACCHAROMYCES CEREVISIAE IN BEET SUGAR PRODUCTION

Research article

Karpova N.N.^1, *, Mogilevskaya I.V.², Semenova O.Yu.³, Kolotova O.V.⁴, Suprunyuk A.S.⁵, Zibarov E.V.⁶, Kravchenko T.V.⁷

⁴ ORCID: 0000-0002-2206-2822;

^1-7 Volgograd State Technical University, Volgograd, Russia

* Corresponding author (karpovand9799[at]mail.ru)

Abstract

The article analyzes the methods of obtaining the dextranase enzyme and examines the main issues of beet sugar production related to the effect of the Leuconostoc mesenteroides strain on the properties of the obtained beet juice during the technological process. Methods of obtaining the enzyme using various microorganisms are also considered. The study compiles comparative characteristics of the sources of obtaining the enzyme. The main advantages of using yeast in the cultivation of dextranase are the preservation of their enzymatic activity and a high growth rate compared to fungal cultures. The study also determines the necessary components contributing to the growth of the biomass of the Saccharomyces cerevisiae Y-1531 strain as well as obtains the quantitative characteristics of the additives for the optimal composition of the medium for cultivation. According to the results of experimental studies, the optimal additives for the strain under study are magnesium in concentration (0.06 %), zinc in concentration (0.01%), calcium (0.02%), sodium succinic acid (0.005%) and vitamin B1 in concentration (0.04%).

Keywords: the dextranase enzyme, yeast, sugar beet, enzymatic hydrolysis, beet sugar production, trace elements.

Введение

Одним из основных промышленных применений декстраназ является снижение шламообразования в процессах производства сахара [1, С.862]. Декстраназа – фермент, способный деполимеризировать декстран в свекольном и тростниковом соке [2, С.287]. Во время хранения и переработки сахарной свеклы происходят потери сахарозы из-за микробной активности. Одной из причин является образование слизистых микробных полисахаридов, которые вызывают серьезные проблемы с обработкой и качеством [1, С.862]. Подбор состава питательной среды играет важную роль при культивировании микроорганизмов, так как обеспечивает рост продуцента и синтез целевого продукта, нехватка того или иного компонента способствует угнетению роста штамма.

Цель исследования заключалась в подборе компонентов питательной среды для создания оптимальных условий культивирования штамма Saccharomyces cerevisiae Y-1531.

Для достижения цели был осуществлен анализ научной литературы. По результатам литературного обзора была составлена сравнительная характеристика источников получения фермента и проведена серия экспериментов по определению оптимального состава питательной среды.

Методы исследования

Настоящая работа выполнена в 2020-2021гг.

В ходе лабораторного исследования использовали метод поверхностного культивирования для определения потребностей в различных источниках для штамма Saccharomyces cerevisiae Y-1531. Оценку роста исследуемой культуры в жидких питательных средах проводили с помощью фотоколориметрического метода с использованием фотоколориметра КФК – 2 УХЛ – 4.2 (λ= 590 нм). Анализ и обобщение полученных данных проводили с использованием математических методов обработки результатов.

Полисахарид декстран, как известно, не является естественным компонентом сахарного тростника и сахарной свёклы. Он образуется в них после сбора урожая в результате необратимого расщепления сахарозы под воздействием бактерий рода Leuconostoc mesenteroides [3 С. 30]. При переработке зараженного бактериальными культурами сахарного тростника декстран переходит в сок, значительно увеличивая его вязкость и снижая скорость фильтрации, замедляет кристаллизацию сахарозы, ухудшая гранулометрический состав сахара, выражающийся в снижении равномерности кристаллов и увеличении количества конгломератов, что ведет к возрастанию его гигроскопичности и повышению опасности порчи при хранении [4, С. 13].

Большинство методов, используемых для удаления декстрана из растворов сахара, основаны на его ферментативном гидролизе. Декстраназы снижают молекулярную массу и, следовательно, вязкость соков.

Декстраназы представляют собой ферменты, которые расщепляют гликозидные связи альфа – 1,6 декстрана с образованием либо глюкозы, либо изомальтозы (экзодекстраназы), либо изомальтоолигосахаридов (эндодекстраны), и вырабатываются в виде внеклеточных ферментов только небольшим количеством бактерий и грибов, включая дрожжи [5 C. 306]. Как правило, декстрангидролизующие ферменты имеют высокую субстратную специфичность [5 С. 310].

В начале 50-х годов прошлого века японские исследователи выявили грибы Penicillium lilacinum и Penicillium funiculosum, которые продуцируют декстраназу в присутствии декстранов, а затем и другие штаммы 60-х от Chaetomium gracile и Gibellela funiculosum [6 С. 1113]. Грибковые декстраназы Chaetomium sp. показали лучшие результаты при обработке декстраном как в соках, так и в сиропах сахарного производства [7 С. 127]. Chaetomium gracile продуцировал эндодекстраназы, а максимальный гидролиз декстрана до глюкозы составил 55 %. Декстраназа активна при оптимальной температуре 55 – 60 °C и 5,0-7,0 (80 % активно при pH 6,5). Известно, что плесень является наиболее распространенным источником внеклеточных эндодекстраназ и проявляет более высокую ферментативную активность, чем декстраназы бактерий. Есть только одно сообщение о внутриклеточной плесневой декстраназе, обнаруженной в Penicillium lilacinum NRRL 896 и Penicillium funiculosum NRRL 1132. Продуктами гидролиза декстраназы Penicillium notatum являются изомальтоза и изомальтотриоза с небольшим количеством глюкозы, как и в большинстве декстраназ грибов [5 С. 310–311].

До этого было идентифицировано несколько бактерий, продуцирующих декстраназу, среди которых были штаммы Lactobacillus bifidus, два вида Bacillus и кишечные бактерии, идентифицированные в 50-х годах прошлого века. Декстраназа Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum, опубликованная в 1974 г. японскими исследователями, имела характеристики, совершенно отличные от уже изученных [7 С. 126–127]. Особенностью бактериальных продуцентов является способность некоторых из них к биосинтезу одновременно нескольких α – глюкозидаз, отличающихся по локализации и механизму действия [8 С. 1080].

Первое сообщение о декстраназе, продуцируемой дрожжами, в частности штаммом Lipomyces starkey в присутствии декстрана, было выполнено в 1983 году, а впоследствии исследователи из Университета Луизианы получили мутант этого штамма, который продуцировал декстраназу в присутствии глюкозы, как более дешевый субстрат [9 С. 161].

Дрожжи могут вырасти до высокой клеточной плотности за меньшее время, чем плесневые грибные культуры, и поэтому они являются подходящим хозяином для промышленного производства секретируемых белков. Основными продуцентами декстраназ среди дрожжевых культур являются представители семейства Lipomycetaceae. Характеристики декстраназы Lipomyces starkeyi в отношении влияния pH и температуры на активность и стабильность очень похожи на характеристики ферментов Chaetomium и Penicillium.

В таблице 1 приведены основные характеристики некоторых декстраназ [7 С. 129]. Разница в оптимальном диапазоне pH и температуре между ними по отношению к источнику происхождения очевидна. В случае продуктов, полученных из грибов, оптимальные значения pH, как правило, являются слабокислыми, а в случае продуктов, полученных из бактерий, оптимальные значения pH ближе к нейтральному диапазону (см. таблицу 1).

 

Таблица 1 – Оптимальные значения pH и температуры для декстраназ, синтезированных различными микроорганизмами [7 С. 129]

Декстраназы	Источник		Оптимальное значение
			pH	Температура
Естественные	Плесневые грибы	Penicillium lilacinum Penicillium luteum Penicillium funiculosum Penicillium aculeatum Penicillium minioluteum Penicillium notatum Chaetomium gracile Fusarium miniliforme Sporothrix schenkii	5,0 – 5,5 4,0 – 6,0 6,0 4,5 – 5,6 4,5 – 5,0 5,0 5,5 – 11,0 5,5 5,0	53 – 60 ºC 50 ºC НС* 50 ºC 35 ºC 50 ºC 55 и 65 ºC 55 ºC НС
	Бактерии	Brevibacterium fuscum var. Dextranlyticum Streptococcus mutans Streptomyces anulatus (two enzymes) Flavobacterium sp. M-73 Thermoanaerobacter wiegelii Strain of Thermoanaerobacter Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum	7,0 – 7,5   5,5 7,0   7,0 5,5 4,5 – 5,5   5,5	НС   37 ºC 40 и 50 ºC   35 ºC 70 ºC 80 ºC   65 – 70 ºC
	Дрожжи	Lipomyces starkeyi	5,0	55 ºC
Рекомбинантные	Плесневые грибы	Paecilomyces lilacinum in Aspergillus, Fusarium and Gribberella Penicillium minioluteum in Pichia pastoris	НС     4,0 – 5,0	60 ºC     57 ºC

Примечание: *НС – Не сообщается  

Ниже представлена сравнительная характеристика источников получения фермента по результатам анализа литературных источников (см. таблицу 2).

 

Таблица 2 – Сравнительная характеристика источников получения фермента

Источник	Достоинства	Недостатки
Плесневые грибы	высокая ферментативная активность; небольшая площадь, занимаемая установкой получения; надежность в работе; возможность полной автоматизации работы установки;	необходимость учитывать характер образующихся продуктов при гидролизе полисахаридов; время культивирования может занимать от 2 до 14 суток; не все виды обладают высокими показателями роста; некоторые плесневые грибы могут быть ядовиты; споры грибов летучи и могут загрязнять производственные помещения и оказывать негативное влияние на здоровье персонала; сложность в использовании.
Бактерии	скорость роста культур 24 – 48 часов; контролируемость состава среды	крайняя прихотливость в росте и питании, что делает процесс получения и выделения ферментов более дорогостоящим; ферментативная активность менее выражена по сравнению с грибами; необходима разработка комплексного метода выделения

 

Окончание таблицы 2 – Сравнительная характеристика источников получения фермента

Источник	Достоинства	Недостатки
Дрожжи	просты в использовании; скорость роста занимает 12 –24 часа; однородность получаемого продукта; контролируемость состава среды; в препаратах полученных при культивировании дрожжей отсутствует бактериальная ДНК; относительная простота аппаратурного оформления; высокая ферментативная активность у семейства штамма Lipomyces starkeyi	не все ферменты обладают высокой активностью; не все виды обладают высокими показателями роста.

 

По результатам таблицы 2 видно, что дрожжи обладают большими преимуществами по сравнению с плесневыми грибными и бактериальными культурами, а именно: могут сохранить ферментативную активность [9 С. 161], скорость роста дрожжей занимает 12 –24 часа по сравнению с другими микроорганизмами.

На следующем этапе для экспериментального исследования был выбран штамм S.cerevisiae Y-1531 из коллекции ВКПМ, заявленный как продуцент декстраназы. Для исследуемого штамма была проведена серия экспериментов по определению оптимального состава среды. Авторами [10 С. 20] были определены компоненты, необходимые для роста дрожжей. Коэффициент прироста биомассы определяли по формуле (1):

     (1)

где D_эксп. – оптическая плотность бактериальной суспензии в экспериментальной среде, D_контр. – оптическая плотность бактериальной суспензии в контрольной среде.

Результаты

Значение К свыше 100% свидетельствует о более благоприятном для роста бактерий составе питательной среды.

Результаты серии экспериментов представлены в таблице 3.

 

Таблица 3 – Экспериментальные результаты определения коэффициента прироста биомассы S.cerevisiae Y-1531 для подбора оптимального состава среды

№	Питательная среда	Значение К, %
1	ППС*	100,00
2	ПС* без Mg с добавлением Na2SO4	82,83 ± 9,00
3	ПС с заменой NaNO3 на NH4NO3 + Na2HPO4·2H2O	65,13 ± 1,54
4	ПС + ZnSO4 (0,01%)	102,57 ± 8,51
5	ПС + ZnSO4 (0,02%)	48,29 ± 8,99
6	ПС + MnSO4 (0,01%)	89,15 ± 3,93
7	ПС + CaCl2 (0,01%)	94,55 ± 9,61
8	ПС + CaCl2 (0,02%)	105,46 ± 4,61
9	ПС + CaCl2 (0,05%)	88,14 ± 2,41
10	ПС + CaCl2 (0,1%)	57,09 ± 2,95
11	ПС + Na2C4H4O4 (0,001%)	104,75 ± 2,89
12	ПС + Na2C4H4O4 (0,005%)	109,88 ± 9,39
13	ПС + Na2C4H4O4 (0,01%)	100,34 ± 8,49
14	ПС + витамин B1 (0,04%)	101,13 ± 4,64
15	ПС + витамин B6 (0,04%)	88,79 ± 4,52

Примечание: *ППС – полная питательная среда [10]; ** ПС – питательная среда c заменой или добавлением компонентов

 

В ходе эксперимента получили следующие данные:

• Добавление фосфора и увеличение концентрации азота оказывают угнетающий характер на рост исследуемой культуры (среда № 3).
• Выявлено замедление роста исследуемой культуры в средах без ионов Mg²⁺ (среда № 2) и с добавлением ионов Mn²⁺(среда №6) (К_{прироста} < 100 %).
• Добавление ионов Zn²⁺ в концентрации (0,01%) (среда № 4), ионов Са²⁺ (0,02 %) (среда № 8) и янтарнокислого натрия (0,005 %) (среда № 12) стимулируют размножение клеток, что способствует бродильной активности. Янтарнокислый натрий (0,01%) поддерживает рост штамма на уровне контрольного варианта (среда № 13).
• Анализируя влияние добавления витаминов в полную питательную среду на рост S.cerevisiae Y-1531, было выявлено стимулирующие влияние тиамина (среда № 14) и менее выраженное позитивное влияние пиридоксина (среда № 15) на скорость роста штамма.

Заключение

В ходе серии экспериментов изучили влияние микроэлементов, витаминов B1 и B6 и янтарнокислого натрия на интенсивность роста биомассы дрожжевого штамма. Был проведен расчет прироста биомассы культуры.

Исходя из анализа результатов эксперимента, можно сделать вывод, что в качестве жизненно необходимых источников для исследуемого штамма можно порекомендовать магний (0,06%), а также добавление таких микроэлементов, как: цинк в концентрации (0,01 %), кальций (0,02 %) и янтарнокислый натрий (0,005 %), добавление витамина В1 (0,04 %) в качестве фактора роста S.cerevisiae Y-1531.

Полученные теоретические и экспериментальные исследования позволяют говорить о возможности использования изучаемого штамма и подобранных компонентов для питательной среды при культивировании штамма с целью получения фермента декстраназы в свеклосахарном производстве.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Tallgren H. Exopolysaccharide-producing bacteria from sugar beets / Tallgren A. H., Airaksinen U., Weissenberg R. et al. // Applied and environmental microbiology. – 1999. – Vol. 65 (2). – P. 862–864. doi: 10.1128 / AEM.65.2.862-864.1999
2. Карпова Н. Н. Поиск стимулирующих добавок для увеличения роста штамма S. cerevisiae Y-1531 – продуцента декстраназы / Карпова Н. Н., Семенова О. Ю. // Конкурс научно-исследовательских работ студентов Волгоградского государственного технического университета (г. Волгоград, 19-22 мая 2020 г.) / ВолгГТУ, Отдел координации научных исследований молодых учёных УНиИ, Общество молодых учёных. – Волгоград, 2020 – С. 287–288.
3. Эгглстон Д. Успешное применение декстраназы на свеклоперерабатывающих заводах / Эгглстон Д., Дилкз Э., Блоуэрс М., Уинтерс К. // Сахар. – 2017. – № 3. – С. 30–40.
4. Кириллов Н. В. Совершенствование способов очистки полупродуктов сахарного производства с использованием электрохимически активированных растворов: дис. … канд. техн. наук : 05.18.05 / Кириллов Николай Валерьевич – Воронеж, 2009. – 172 с.
5. Khalikova E. Microbial dextran – hydrolyzing enzymes: fundamentals and applications / Khalikova E., Susi P., Korpela T. // Microbiology and molecular biology reviews. – – Vol. 69 (2). – P. 306–325. DOI: 10.1128/MMBR.69.2.306-325.2005.
6. Fukumoto J. Studies on mold dextranases. I. Penicillium luteum dextranase: its production and some enzymatic properties / Fukumoto J., Tsuji H., Tsuru // The Journal of Biochemistry. – 1971. – Vol. 69 (6). – P. 1113–1121. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.jbchem.a129564
7. Jimenez R. E. Dextranase in sugar industry: A review / Jimenez R. E. // Sugar Technology. – 2009. – № 11. – P. 124–134. DOI: 10.1007 / s12355-009-0019-3
8. Takahashi Subcellular localization of D - glucanases in Bacteroides oralis Ig 4a / Takahashi N., Saton Y., Takamori K. // Journal of General Microbiology. – 1985. – Vol. 131. – P. 1077–1082. DOI: 10.1099 / 00221287-131-5-1077
9. Koenig D. W. The purification and characterization of a dextranase from Lipomyces starkeyi / Koenig D. W., Day D. F. // European Journal of Biochemistry. – 1989. – Vol. 183(1). – P. 161–167. DOI: 1111/j.1432-1033.1989.tb14908.x
10. Карпова Н. Н. Подбор компонентов питательной среды для штамма S. cerevisiae Y-1531 – продуцента декстраназы / Карпова Н. Н., Могилевская И. В. // XVI Ежегодная молодёжная научная конференция «Юг России: вызовы времени, открытия, перспективы» : материалы конф. (г. Ростов-на-Дону, 13-28 апреля 2020 г.) / ФИЦ Южный научный центр РАН, Российский фонд фундаментальных исследований. – Ростов-на-Дону, 2020. – C. 20.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Tallgren H. Exopolysaccharide-producing bacteria from sugar beets / Tallgren A. H., Airaksinen U., Weissenberg R. et al. // Applied and environmental microbiology. – 1999. – Vol. 65 (2). – P. 862–864. doi: 10.1128 / AEM.65.2.862-864.1999
2. Karpova N. N. Poisk stimuliruyushih dobavok dlya uvelicheniya rosta shtamma cerevisiae Y-1531 – producenta dextranazu [The search for stimulating additives to increase the growth of S. cerevisiae Y-1531 strain - a producer of dextranase] / Karpova N. N., Semenova O. Yu. // Konkurs nauchno-issledovatel’skih rabot studentov Volgogradskogo gosudarstvennogo tehnicheskogo universiteta [Competition of research works of students of the Volgograd State Technical University] (Volgograd, 19-22 may 2020 g.) / VolgGTU, Otdel koordinacii nauchnuh issledovaniy moloduh uchenuh UNiI, Obshestvo moloduh uchenuh [Volgograd State Technical University, Department for Coordination of Scientific Research of Young Scientists UNiI, Society of Young Scientists]. – Volgograd, 2020 – P. 287–288. [in Russian]
3. Eggleston D. Uspeshnoe priminenie dextranazu na sveklopererabatuvayushih zavodah [Successful application of dextranase in sugar beet factories] / Eggleston D., Dilks A., Blowers M., Winters K.// Sahar [Sugar]. – 2017. – № 3. – 30–40. [in Russian]
4. Kirilov N. V. Sovershenstvovsnie sposobov ochistki poluproduktov saharnogo proizvodstva s ispolzovaniem elektrohimicheski aktivirovannuh rastvorov [Improvement of methods for purification of intermediate products of sugar production using electrochemically activated solutions] : dis. … PhD in Engineering : 05.18.05 / Kirillov Nikolay Valerievich. – Voronezh, 2009. –172 p. [in Russian]
5. Khalikova E. Microbial dextran – hydrolyzing enzymes: fundamentals and applications / Khalikova E., Susi P., Korpela T. // Microbiology and molecular biology reviews. – – Vol. 69 (2). – P. 306–325. DOI: 10.1128/MMBR.69.2.306-325.2005.
6. Fukumoto J. Studies on mold dextranases. I. Penicillium luteum dextranase: its production and some enzymatic properties / Fukumoto J., Tsuji H., Tsuru // The Journal of Biochemistry. – 1971. – Vol. 69 (6). – P. 1113–1121. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.jbchem.a129564
7. Jimenez R. E. Dextranase in sugar industry: A review / Jimenez R. E. // Sugar Technology. – 2009. – № 11. – 124–134. DOI: 10.1007 / s12355-009-0019-3
8. Takahashi Subcellular localization of D - glucanases in Bacteroides oralis Ig 4a / Takahashi N., Saton Y., Takamori K. // Journal of General Microbiology. – 1985. – Vol. 131. – P. 1077–1082. DOI: 10.1099 / 00221287-131-5-1077
9. Koenig D. W. The purification and characterization of a dextranase from Lipomyces starkeyi / Koenig D. W., Day D. F. // European Journal of Biochemistry. – 1989. – Vol. 183(1). – P. 161–167. DOI: 1111/j.1432-1033.1989.tb14908.x
10. Karpova N. N. Podbor komponentove pitatelnoy sredu dlya shtamma cerevisiae Y-1531 – producenta dextranazu [Selection of culture medium components for S. cerevisiae strain Y-1531-dextranase producer] / Karpova N. N., Mogilevskaya I. V. // XVI Ezhegodnaya molodezhnaya nauchnaya konferenciya «Yug Rossii: vuzovu vremeni, otkrutiya, perspektivu» : material konf. (Rostov-on-Don, 13-28 aprel’ 2020) [XVI Annual Youth Scientific Conference "South of Russia: Challenges of Time, Discoveries, Prospects": materials of the conf. (Rostov-on-Don, April 13-28, 2020)] / FIC Yushnuy nauchnuy centr RAN, Rossiyskiy fond fundametalnuh issledovaniy [Federal Research Center Southern Scientific Center of the Russian Academy of Sciences, Russian Foundation for Basic Research]. – Rostov-on-Don, 2020. –20 p. [in Russian]