Наши журналы
Опубликовать статью Вход и регистрация
Расширенный поиск
Разделы статьи

ВЛИЯНИЕ РАЗНОРАЗМЕРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЦИНКА НА ПОДЪЕМНУЮ СИЛУ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Научная статья
Ларин С. Л.
Будко Е. В.
Хабаров А. А.
DOI:
https://doi.org/10.18454/IRJ.2016.47.129
Выпуск: № 5 (47), 2016
Опубликована:
2016/05/20
PDF

Ларин С. Л.1, Будко Е. В.2, Хабаров А. А.3

1ORCID: 0000-0001-7308-088X, Аспирант; 2ORCID: 0000-0001-8861-7491, Профессор, Доктор фармацевтических наук; 3Профессор, Доктор фармацевтических наук, Курский государственный медицинский университет

ВЛИЯНИЕ РАЗНОРАЗМЕРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЦИНКА НА ПОДЪЕМНУЮ СИЛУ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Аннотация

В статье представлено исследование воздействия неорганических соединений Zn различного размера и морфологии (технические образцы ZnO, Zn(OH)2 и ZnSO4, микронизованные различными способами образцы ZnO и синтезированные образцы наноразмерного Zn(OH)2) на подъемную силу тест-культуры Saccharomyces cerevisiae. Показана высокая активность малорастворимых соединений при сравнении с ионной формой. Наблюдается зависимость биологического отклика от морфологии и размерности исследованных соединений.

Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, подъемная сила, оксид цинка, гидроксид цинка, наночастицы, микрочастицы, форма наночастиц.

Larin S. L.1, Budko E. V.2, Khabarov A. A.3

1ORCID: 0000-0001-7308-088X, Postgraduate student; 2ORCID: 0000-0001-8861-7491,  Professor, PhD in Pharmaceutics; 3Professor, PhD in Pharmaceutics, Kursk State Medical University

EFFECT OF DIFFERENT SIZED ZINC COMPOUNDS ON THE LIFTING FORCE OF THE TEST CULTURE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Abstract

The article presented a study of the effects of inorganic Zn compounds of various size and morphology (technical samples ZnO, Zn(OH)2 and ZnSO4, micronized by different ways ZnO samples and synthesized nanoscaled Zn(OH)2) to the lifting force of the test culture of Saccharomyces cerevisiae. High activity of slightly soluble connections when comparing with an ionic form is shown. Dependence of a biological response on morphology and dimension of the studied connections is observed.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, lifting force, zinc oxide, zinc hydroxide, nanoparticles, microparticle, form of nanoparticles.

Среди микронутриентов, критически необходимых для поддержания нормального уровня гомеостаза живого организма особенно выделяется цинк [8]. Дополнительное введение микроэлемента проводится, как правило, с применением растворимых – ионизированных соединений. Это связано с пониманием общих механизмов транспорта металлов через перемещение ионов посредством семейства переносчиков Zip и ZnT [12, 15].

Однако, с развитием технологий диспергирования, возрос интерес к исследованию биологической активности микро- и наноразмерых малорастворимых соединений. Так, в эксперименте показано повышение всасываемости оксида цинка при измельчении до наноразмерного состояния [4, 14], установлен приемлемый уровень доступности для оксида и карбоната цинка [7], сопоставимый уровень поглощения для сульфата и гидроксида цинка [10].

Результат биологической активности соединений цинка может быть продемонстрирован на культуре хлебопекарных дрожжей Sacсharomyces сerevisiae. Исходя из биологического действия элемента, активность его соединений может проявляться в угнетении ферментов зимазного комплекса или в их активации. Ранее нами было выявлено токсическое воздействие растворимых хлорида и ацетата цинка на культуру S.сerevisiae и слабое активирующее воздействие в присутствии малых количеств сульфата цинка в растворе [13]. Учитывая зависимость биологического действия соединений от размера и морфологии частиц, возникает необходимость исследования активности предложенных нами частиц неорганических соединений цинка разной степени диспергирования в отношении дрожжей.

Целью работы являлось сравнительное изучение воздействия некоторых растворимых и нерастворимых неорганических соединений цинка на активность процесса брожения методом оценки подъемной силы тест-культуры Sacсharomyces сerevisiae.

Активность дрожжей определена по ускоренному методу определения подъемной силы. От средней пробы дрожжей хлебопекарных прессованных высокоактивных «Премиум» (ОАО «Комбинат пищевых продуктов», СПб, Россия, ТУ 9182–008–00353595–2004) отбирали навеску, к которой прибавляли массу исследуемого соединения. Полученную массу замешивали в тесто с приданием ему формы шарика, шарик помещали в стакан с водой температуры 35оС и термостатировали. Количество параллельных опытов 5-6. При отсутствии всплытия наблюдения продолжали не менее 1,5 часов. Результаты представлены как отношение времени всплытия шарика пробы (в %) к времени всплытия шарика холостой пробы (100%) данной серии опыта.

В работе использованы промышленные образцы соединений цинка: ZnO (ХЧ, ГОСТ 10262-73, Реахим, СПб), Zn(NO3)2×6H2O (ХЧ, ГОСТ 5106–77, Реахим, СПб), ZnSO4×7H2O (ХЧ, ГОСТ 4174–77, Реахим, СПб), ZnCl2 (ЧДА, ГОСТ 4529–78, Реахим, СПб) и образцы, полученные в лабораторных условиях. Образец сухой гидроокиси цинка был получен сливанием растворов ZnCl2 и KOH (ХЧ, ГОСТ 24363-80, Реахим, СПб) с последующей фильтрацией и сушкой при 25оС. ZnO микронизированный получен измельчением промышленного образца оксида цинка на шаровой вибрационной мельнице МЛ-1 в течение 15 минут [16]. Образцы гелеобразного гидроксида цинка и синтезированного оксида цинка получены по методике, описанной в работе [6, 17].

Характеристики соединений цинка, использованных в исследовании, представлены в таблице 1. Характеристики образцов Zn(OH)2 гелеобразный, ZnO микронизованный и ZnO синтезированный были ранее описаны нами в работах [6, 17].

 

Таблица 1 – Соединения цинка, применявшиеся в эксперименте и их характеристики (на основании справочных и собственных данных)

№, п/п Наименование образца Кристаллическая структура частиц насыщенный раствор (20°С) моль/л Размерность частиц
1 2 3 4 5
1 ZnSO4 х 7Н2О орторомбические кристаллы 1.3 -
4 Zn(OH)2 сухой лабораторный Бипирамидальная - Ромбическая сингония 2.3 х 10-6 более 10 мкм
  Zn(OH)2 лабораторный гелеобразный Бипирамидальная - 2-3 нм (собственные исследования)
6 ZnO промышленный Гексагональная - более 10 мкм
7 ZnO лабораторный микронизованный Без выраженной структуры (собственные исследования) 5.1 х 10-5 180 нм (собственные исследования)
8 ZnO сухой лабораторный Гексагональная (собственные исследования) - 955 нм (собственные исследования)
 

Для обработки полученных экспериментальных данных, а также для реализации метода наименьших квадратов при построении графиков использовали ПО OriginPro 8.5.1 SR1 (OriginLab Corporation, США). Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета программ Statistica 10 (StatSoft Inc, США) и Microsoft Excel 14 (Microsoft, США).

В присутствии соединений ZnO промышленный, ZnO микронизованный, ZnO синтезированный, Zn(OH)2 гелеобразный, Zn(OH)2 сухой была определена подъемная сила тест-культуры S.сerevisiae. В качестве препарата сравнения был выбран цинка сульфат, по причине широкого применения в качестве источника ионов Zn2+. Полученная зависимость степени изменения подъемной силы тест-культуры S.cerevisiae (%) от количества цинка на 1 г дрожжей (мг/г), представлена на рисунке 1.

25-05-2016 09-29-14

Рис. 1 – Зависимость степени изменения подъемной силы тест-культуры S.сerevisiae (%) от концентрации Zn2+ на 1 г дрожжевой смеси (мг/г)

В исходных количествах все представленные в эксперименте соединения вызывают снижение активности дрожжей. Наибольшей угнетающей способностью обладает Zn(OH)2 гелеобразный (рис. 1, кривая 5) и Zn(OH)2 сухой (рис. 1, кривая 6). Для образцов ZnO синтезированный (рис. 1, кривая 3) и ZnSO4 (рис. 1, кривая 4) отмечается средний уровень угнетения культуры S.сerevisiae, для образцов ZnO промышленный (рис. 1, кривая 1) и ZnO микронизованный (рис. 1, кривая 2) выявлен минимальный уровень негативного воздействия на тест-культуру. При сравнении воздействия на культуру S.cerevisiae малорастворимого гидроксида цинка (рис. 1, кривая 5,6) и растворимого сульфата цинка (рис. 1, кривая 4) отмечается увеличение времени всплытия тестяных шариков в 1.5-2 раза при использовании эквивалентной массы малорастворимого образца.

При сравнении активности измельченных образцов цинка оксида (кривая 1, 3) и цинка гидроксида (кривая 5, 6) наглядно проявляется увеличение в 1.5-2 раза ингибирующего действия на тест-культуру при уменьшении размера частиц с одной стороны и придании последним правильной геометрической формы с другой. Помимо угнетения активности тест-культуры S.cerevisiae для образцов ZnO микронизованный (кривая 2) и ZnO синтезированный (кривая 3) при содержании цинка порядка 5-10 мг/г наблюдается активирующее действие.

Для оценки токсического влияния остаточного этанола в образце гелеобразного Zn(OH)2 был проведен эксперимент с измерением активности дрожжей в присутствии остаточного количества этанола. Было выявлено, что этанол незначительно угнетает активность дрожжевой культуры, уменьшая подъемную силу в 1.2-1.3 раза при стартовых концентрациях, и практически не изменяет ее уже через 2-3 пропорциональных уменьшений массы спирта. Таким образом, остаточные количества этанола практически не влияют на активность ферментов зимаазного комплекса тест-культуры S.cerevisiae, что также подтверждается литературными данными [2, 9].

Дозозависимое угнетение активности S.cerevisiae разноразмерными соединениями цинка отмечено всеми авторами. Отмечается [2], что при увеличении концентрации до 10-15 мМ, активность тест-культуры резко падает. Это согласуется с данными полученными нами в эксперименте: при размерности цинка оксида 180 нм резкое падение активности S.cerevisiae начинается при содержании 13.8 мМ (рис. 1, кривая 2,3). Исследование [5] взаимодействия наночастиц (в сравнении с промышленными образцами) оксида цинка размером 50 нм на культуру хлебопекарных дрожжей показало, что полумаксимальная эффективная концентрация для обоих соединений приблизительно равна и находится на уровне 121 – 158 мг ZnO на литр. Такое значение, однако, несколько выше, чем полученное нами в эксперименте (порядка 50-80 мг ZnO на литр). Отмечается, что максимум ингибирования (угнетение около 80%) наблюдается при воздействии 250 мг ZnO на литр. Причиной такого ингибирования являются исключительно солюбилизированные Zn-ионы, что также подтверждается исследованием с рекомбинантным Zn-сенсорным микроорганизмом.

Активирующее действие на культуру S.cerevisiae в эксперименте объяснимо сочетанием необходимой для нормального функционирования дрожжевой клетки концентрации соединения и позитивного влияния на ферменты, содержащие в своем составе ионы цинка. Так, при исследовании взаимодействия тест-культуры S.cerevisiae с наночастицами оксида цинка размером 50 нм, авторами [2] отмечается стимулирование активности дрожжей при количествах 5 мМ.

На первом этапе сбраживания участвуют только ферменты, локализованные на поверхности клеточной стенки дрожжевой клетки и уже после перестройки ферментативного комплекса, включаются ферменты локализованные внутри клетки. Основываясь на времени адаптации ферментативного комплекса дрожжевой культуры, следует отметить, что все соединения, представленные в эксперименте, оказывают ингибирующее действие на ферменты, локализованные на поверхности дрожжевой клетки, что проявляется в уменьшении скорости газообразования. В процессе эксперимента образцы ZnO синтезированный (рис. 2, кривая 3) и Zn(OH)2 гелеобразный (рис. 2, кривая 5) при начальной концентрации вызывали гибель тест-культуры (о чем говорит отсутствие стартовой точки на графике). Такое явление могло наблюдаться, только в случае ингибирования и внешних и внутренних ферментов, что говорит о проникновении большого количества соединения внутрь клетки. Следует отметить, что вышеперечисленные образцы обладают правильной геометрической структурой и малым размером.

Аномальное увеличение активности малорастворимого соединения в отношении дрожжевой клетки связывают со способностью оксида цинка к частичной диссоциации и солюбилизации в водном растворе [5, 11]. Эти процессы способствуют формированию гидратированной частицы, которая обладает повышенным стерическим соответствием и как следствие повышенной способностью к транспорту через ионные каналы дрожжевой клетки. Резкое угнетение жизнедеятельности дрожжевой культуры в присутствии наночастиц ZnO и Zn(OH)2, по видимости, связано с повышенным образованием активных форм кислорода, который в свою очередь угнетает активность ферментативных систем.

Сравнение активности малоразмерных частиц различного размера и морфологии – Zn(OH)2 гелеобразный (октаэдрическая форма, размер 2-3 нм), ZnO микронизованный (неправильная форма, размер 180.4 нм), ZnO синтезированный (гексагональная форма, размер 955.6 нм) демонстрирует значительное влияние этих параметров на активность тест-культуры S.cerevisiae. Частицы минимального размера и правильной формы Zn(OH)2 гелеобразный (рис. 2, кривая 5) проявляют максимальный уровень угнетения активности дрожжевой культуры, что связано с повышенной способностью к проникновению частиц малого размера через ионные каналы клетки. Наблюдается уменьшение ингибирования активности тест-культуры по критерию геометрической формы частицы в ряду «октаэдрическая форма – гексагональная форма – неправильная форма». Такое влияние на активность клетки также может быть связано с особенностями стерической конфигурации ионных каналов дрожжевой клетки.

В таблице 2 представлена сводная информация по исследованиям активности наносоединений цинка в отношении различных микроорганизмов.

Таблица 2 - Активность наноразмерных соединений цинка в отношении тест-культур микроорганизмов

25-05-2016 09-35-33  

Токсичность соединения зависит как от формы, в которой он введен в живую систему, так и от тест-культуры. Достаточно высокий порог токсичности для наноразмерного оксида цинка в отношении S.cerevisiae, который может достигать 1000 мг ZnO на литр [11], объясним наличием в дрожжевой клетке вакуолей и цинкосом [5], обеспечивающих накопление избытка цинк-ионов без вреда для клетки. Токсичность наноразмерного оксида цинка показана также и для других микроорганизмов, например, в работе [3] определена полумаксимальная эффективная концентрация наночастиц ZnO (50 нм) для культуры V.fischeri. Значение ЕС50 составило 1.1 – 1.9 мг в литре, что сопоставимо с токсичнстью As5+ (1.5 мг в литре). Авторами [1] установлено, что наночастицы оксида цинка размером 480 нм ингибируют активность более 90% тест-культуры B.subtilis уже при содержании 10 мг ZnO в литре.

Активность нерастворимых соединений цинка – ZnO микронизованного, Zn(OH)2 гелеобразного и Zn(OH)2 сухого в отношении тест-культуры существенно выше, чем активность ионной формы – сульфата цинка; наблюдается стабильное ингибирование активности S.cerevisiae в 1.5-2 раза большее в сравнении с ZnSO4.

Соединения цинка меньших размеров и «правильной» формы оказывают большее воздействие, чем асимметричные частицы близкого размера.

Высокая активность малоразмерных форм в отношении тест-культуры S.cerevisiae позволяет сделать вывод о потенциальной биологической активности в отношении более сложных организмов, что может быть подтверждено опытами in vivo.

Литература

  1. Adams L.K., Lyon D.Y., Alvarez P.J.J. Comparative eco-toxicity of nanoscale TiO2, SiO2, and ZnO water suspensions. // Water Resources. – 2006. - №40. – РР.3527–3532.
  2. Ban D.K., Paul S. Zinc oxide nanoparticles modulates the production of β-glucosidase and protects its functional state under alcoholic condition in Saccharomyces cerevisiae. // Applied Biochemistry and Biotechnology. – 2014. - №173. – PP. 155-166.
  3. Heinlaan, H., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H.C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus paltyurus. // Chemosphere. - №71. – РР. 1308–1316.
  4. Hilty F.M., Arnold M., Hilbe M. oth. Iron from nanocompounds containing iron and zinc is highly bioavailable in rats without tissue accumulation. // Nature nanotechnology. - №5. – PP. 374 – 380.
  5. Kasemets K., Ivask A., Dubourguier H.C., Kahru A. Toxicity of nanoparticles of ZnO, CuO and TiO2 to yeast Saccharomyces cerevisiae. // Toxicology in Vitro. – 2009. - №23. – РР. 1116 – 1122.
  6. Larin S.L., Orlov E.Y., Borsch N.A., Gorbacheva L.A., Budko E.V., Khabarov A.A. Synthesis and Identification of Zinc Oxide Nanoparticles as Precursor for Getting Zinc-Based Biologically Active Additives. // Журнал нано- та електронної фізики. – 2013. - №4. - PP. 04032-1 – 04032-2.
  7. Lucia C.M.D., Sattos L.L.M, Rodrigues K.C.C. oth. Bioavailability of zinc in wistar rats fed with rice fortified with zinc oxide. // Nutrients. – 2014. - №6. – PP. 2279-2289.
  8. Maret W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to key element of life. // Advances in nutrition. – 2013. - №4. – PP. 83-91.
  9. Nunoura N., Ohdan K., Yano T., Yamamoto K., Kumadai H. Purification and characterization of β-D-glucosidase (β-D-fructosidase) from Bifidobacterium breve clb acclimated to cellobiose. // Bioscience. Biotechnology. Biochemistry. – 1996. - №2 – PP. 188-193.
  10. Salgueiro M.J., Bioch, Zubillaga B. oth. Bioavailability, biodistribution, and toxicity of BioZn-AAS: a new zinc source. Comparative studies in rats. // Nutrition. – 2000. - №16. - 762-766.
  11. Schmitt, M., Gellert, G., Ludwig, J., Lichtenberg-Frate, H. Phenotypic yeast growth analysis for chronic toxicity testing. // Ecotoxicology and Environmental Safety. – 2004. -№59. – РР. 142–150.
  12. Zalups R.K., Koropatnick J. Cellular and molecular biology of metals. – NW.: CRC Press, 2010. – 425 c.
  13. Будко Е.В., Хабаров А.А., Конопля А.И., Горбачева Л.А., Ельцова Н.О. Обогащение дрожжей солями цинка // Научные ведомости. БелГУ. Серия Медицина, Фармация. - 2012. - № 10. - С. 90-94.
  14. Распопов Р.В., Бузулуков Ю.П., Марченков Н.С. и др. Биодоступность наночастиц оксида цинка. Изучение методом радиоактивных индикаторов. // Вопросы питания. – 2010. - №6. – С. 14-18.
  15. Торшин И.Ю., Громова О.А., Гришина Т.Р., Рудаков К.В. Иерархия взаимодействия цинка и железа: физиологические, молекулярные и клинические аспекты. // Трудный пациент. – 2010. - №3. – С. 45-53.
  16. Хабаров А.А., Будко Е.В., Жилякова Е.Т., Новиков О.О., Новикова М.Ю., Попов Н.Н., Ванхин О.А. Изучение изменения технологических характеристик порошка цинка оксида в процессе его твердофазной механохимической обработки // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. - 2012. - № 22. - С. 116 - 120.
  17. Будко Е.В., Хабаров А.А., Ларин С.Л. Синтез и характеристика малоразмерных соединений цинка для коррекции гипоцинкозов. // Перспективные материалы. – 2016. - №3. - С. 41-46.

 References

  1. Adams L.K., Lyon D.Y., Alvarez P.J.J. Comparative eco-toxicity of nanoscale TiO2, SiO2, and ZnO water suspensions. // Water Resources. – 2006. - №40. – РР.3527–3532.
  2. Ban D.K., Paul S. Zinc oxide nanoparticles modulates the production of β-glucosidase and protects its functional state under alcoholic condition in Saccharomyces cerevisiae. // Applied Biochemistry and Biotechnology. – 2014. - №173. – PP. 155-166.
  3. Heinlaan, H., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H.C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus paltyurus. // Chemosphere. - №71. – РР. 1308–1316.
  4. Hilty F.M., Arnold M., Hilbe M. oth. Iron from nanocompounds containing iron and zinc is highly bioavailable in rats without tissue accumulation. // Nature nanotechnology. - №5. – PP. 374 – 380.
  5. Kasemets K., Ivask A., Dubourguier H.C., Kahru A. Toxicity of nanoparticles of ZnO, CuO and TiO2 to yeast Saccharomyces cerevisiae. // Toxicology in Vitro. – 2009. - №23. – РР. 1116 – 1122.
  6. Larin S.L., Orlov E.Y., Borsch N.A., Gorbacheva L.A., Budko E.V., Khabarov A.A. Synthesis and Identification of Zinc Oxide Nanoparticles as Precursor for Getting Zinc-Based Biologically Active Additives. // Zhurnal nano- ta elektronnoї fі – 2013. - №4. - PP. 04032-1 – 04032-2.
  7. Lucia C.M.D., Sattos L.L.M, Rodrigues K.C.C. oth. Bioavailability of zinc in wistar rats fed with rice fortified with zinc oxide. // Nutrients. – 2014. - №6. – PP. 2279-2289.
  8. Maret W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to key element of life. // Advances in nutrition. – 2013. - №4. – PP. 83-91.
  9. Nunoura N., Ohdan K., Yano T., Yamamoto K., Kumadai H. Purification and characterization of β-D-glucosidase (β-D-fructosidase) from Bifidobacterium breve clb acclimated to cellobiose. // Bioscience. Biotechnology. Biochemistry. – 1996. - №2 – PP. 188-193.
  10. Salgueiro M.J., Bioch, Zubillaga B. oth. Bioavailability, biodistribution, and toxicity of BioZn-AAS: a new zinc source. Comparative studies in rats. // Nutrition. – 2000. - №16. - 762-766.
  11. Schmitt, M., Gellert, G., Ludwig, J., Lichtenberg-Frate, H. Phenotypic yeast growth analysis for chronic toxicity testing. // Ecotoxicology and Environmental Safety. – 2004. -№59. – РР. 142–150.
  12. Zalups R.K., Koropatnick J. Cellular and molecular biology of metals. – NW.: CRC Press, 2010. – 425 c.
  13. Budko E.V., Habarov A.A., Konoplja A.I., Gorbacheva L.A., Elcova N.O. Obogashhenie drozhzhej soljami tsinka // Nauchnye vedomosti. BelGU. Serija Medicina, Farmacija. - 2012. - № 10. - S. 90-94.
  14. Raspopov R.V., Buzulukov U.P., Marchenkov N.S. i dr. Biodostupnost nanochastic oksida tsinka. Izuchenie metodom radioaktivnyh indikatorov. // Voprosy pitanija. – 2010. - №6. – S. 14-18.
  15. Torshin I.U., Gromova O.A., Grishina T.R., Rudakov K.V. Ierarhija vzaimodejstvija tsinka i zheleza: fiziologicheskie, molekuljarnye i klinicheskie aspekty. // Trudnyj pacient. – 2010. - №3. – S. 45-53.
  16. Khabarov A.A., Budko E.V., Zhiljakova E.T., Novikov O.O., Novikova M.U., Popov N.N., Vanhin O.A. Izuchenie izmenenija tehnologicheskih harakteristik poroshka tsinka oksida v processe ego tverdofaznoj mehanohimicheskoj obrabotki // Nauchnye vedomosti BelGU. Serija Medicina, Farmacija. - 2012. - № 22. - S. 116 - 120.
  17. Budko E.V., Khabarov A.A., Larin S.L. Sintez i harakteristika malorazmernyh soedinenij cinka dlja korrekcii gipocinkozov. // Perspektivnye materialy. – 2016. - №3. - S. 41-46.