К ВОПРОСУ О СОВРЕМЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ РАЗМНОЖЕНИЯ ХВОЙНЫХ ДРЕВЕСНЫХ ПОРОД

Краснопёрова В.В.¹, Исламова Н.А.², Бухарина И.Л.³

¹Аспирант, Ижевская государственная сельскохозяйственная академия, младший научный сотрудник, Удмуртский научно-исследовательский институт сельского хозяйства; ²Магистрант, Удмуртский государственный университет; ³Доктор биологических наук, Профессор, Удмуртский государственный университет

К ВОПРОСУ О СОВРЕМЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ РАЗМНОЖЕНИЯ ХВОЙНЫХ ДРЕВЕСНЫХ ПОРОД

Аннотация

Изучены технологии вегетативного размножения хвойных растений современными биотехнологическими методами для нужд лесного и садово-паркового хозяйства. В культуру in vitro введены ель колючая и туя западная, с последующим микроклональным размножением полученных регенерантов. Отмечено влияние состава питательной среды на продолжительность культивирования и скорость образования каллуса у эксплантов ели колючей. Выявлена зависимость частоты пересадки эксплантов туи западной на выживаемость растений в культуре in vitro.

Ключевые слова: вегетативное размножение, культура in vitro, хвойные породы, питательная среда.

Krasnoperova V.V.¹, Islamova N.A.², Bukharina I.L.³

¹Postgraduate student, Izhevsk State Agricultural Academy, junior researcher, Udmurt Research Institute of Agriculture; ² Undergraduate, Udmurt State University; ³PhD in Biology, Professor, Udmurt State University

THE ISSUE OF MODERN TECHNOLOGY BREEDING CONIFEROUS TREE SPECIES

Abstract

Modern biotechnological methods of vegetative propagation of conifers are presented in the article. Picea pungens Engelm and Thuja occidentalis L. were introduced in vitro culture. Then we spent micropropagation obtained regenerated coniferous rasteniya. We have noted the influence of the composition of the culture medium for the duration of the culture, and the rate of formation of callus from explant spruce barbed. The influence transplant explants arborvitae west on plant survival in culture in vitro were revealed.

Keywords: vegetative propagation, culture in vitro, conifers, growing medium.

Микроклональное размножение растений является одним из перспективных направлений развития науки XXI столетия. Среди основных преимуществ микроклонального размножения перед традиционным вегетативным способом является высокий коэффициент размножения, расширение сезонности выполняемых работ и выпуск растений к определенному сроку, возможность размножать и укоренять те растения, которые не размножаются или затруднительно размножаются обычными способами, например, быстрое клональное размножение взрослых лесных деревьев, особенно хвойных [1].

Микроклональному размножению посвящены работы ряда авторов. В часности, В.Г. Лебедев и К.А. Шестибратов [2] разработали методику клонального размножения сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) из двухнедельных проростков. Е.В. Юшкова с группой авторов [3] изучила закономерности роста и развития каллусных тканей кедра (Pinus sibirica Rupr.), лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), ели европейской (Picea abies L. Karst.), полученных из ювенильных растений, и вводили в культуру in vitro на среды с различным уровнем гормонов.

В институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН большинство исследований, посвящённых проблеме микроклонального размножения хвойных пород древесных растений in vitro, выполнено методом соматического эмбриогенеза. Использование в качестве эксплантов мегагаметофитов, незрелых зиготических зародышей, семядолей, гипокотиля, микроспороцитов, микроспор и пыльцы у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны сибирской (Pinus sibirica Rupr.), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и кедрового стланика (Pinus pumila Regel.) позволило получить у данных видов растений соматические зародыши и зародышеподобные структуры [4-7].

Недостатком данного метода является наличие контролируемого опыления для получения чистых линий. Строго учитываются сроки взятия образцов – семена собирают в предсемядольной стадии развития зародыша [5].

Уровень наследуемости ценных признаков роста при таком размножении довольно низок [8]. Исходным лесокультурным материалом являются семена, от качества которых в значительной степени зависит успешность выращивания лесных культур.

Вегетативный способ размножения, основанный на культивировании изолированных клеток, тканей и органов растений на искусственных питательных средах в условиях in vitro, позволяет получать посадочный материал независимо от урожая семян и наиболее полно сохранять в потомстве хозяйственно-ценные признаки и свойства материнского растения [9].

Цель исследования – выявить наиболее эффективный способ ускоренного размножения хвойных пород для нужд лесного и садово-паркового хозяйства. В работе использован метод микроклонального размножения растений in vitro, основанный на вычленении точки роста сеянцев и меристематических тканей вегетативных частей средневозрастных древесных растений хвойных пород.

Главная задача для реализации поставленной цели – введение в культуру in vitro видов хвойных растений с последующим микроклональным размножением полученных регенерантов.

Материалы и методы. Объектом исследования служили средневозрастные растения ели колючей (Picea pungens Engelm), ели европейской (Picea abies L. Karst.) и туи западной (Thuja occidentalis L.), произрастающие в естественных условиях.

При введении в культуру in vitro видов хвойных растений использовали стандартную питательную среду Мурасиге-Скугу с добавлением антибиотика, сахарозы, ИУК и активированного угля. В качестве эксплантов использовали верхушечные и боковые почки и части годичных побегов взрослых растений.

Все работы с культурой клеток и тканей in vitro в биотехнологической лаборатории проводили в стерильных условиях. Стерилизация растительного материала проведена путем погружения побегов в 5% раствор гипохлорита натрия (NaOCl) с экспозицией 30 минут. После стерилизации растительные ткани промыли в 3-4 порциях стерильной дистиллированной воды. Затем поверхность почек и части стеблей протирали ватой, смоченной этанолом. После очистки точек роста от почечных чешуй и стеблей от хвои и коры экспланты погрузили в 96º этанол на 30 секунд.

Простерилизованные апикальные почки, освобожденные от почечных чешуй, поместили на питательную среду. Молодые побеги, разрезанные на более мелкие участки длиной около 1 см, также поместили на питательную среду.

Пробирки с эксплантами в течение двух недель культивировали в комнате без доступа света при температуре 22‑25 ^оС и влажности 70%. Дальнейшее культивирование проводили при +26 °C, световом периоде 16 ч и освещённости 4–5 тыс. люкс.

Результаты. Введение в культуру in vitro вегетативных частей ели европейской и ели колючей показало, что данный способ размножения хвойных пород требует тщательного соблюдения всех этапов стерилизации и условий культивирования. На 4-й день после посадки было отмечено побурение большинства эксплантов и их сильное заражение бактериальной микрофлорой. На 10-е сутки культивирования жизнеспособными оставались 83 % почек взрослых растений ели колючей. Причиной гибели почек и побегов ели европейской в основном являлось заражение. Начало образования каллуса на почках зафиксировано на 17-й день культивирования. К этому же времени жизнеспособными осталось 33 % эксплантов, которые в дальнейшем пересаживали каждые две недели на свежую питательную среду без добавления активированного угля. Отмечено, что уголь адсорбирует действие активных веществ в среде и существенно уменьшает их исходную концентрацию, происходит замедление каллусообразования. При культивировании эксплантов на питательной среде без активированного угля скорость нарастания каллусной массы увеличилась. Перед третьим пассажем было произведено деление эксплантов по продольной оси.

Черенки туи западной также были посажены на питательную среду с добавлением активированного угля.  Сорок процентов эксплантов через две недели культивирования оказалось зараженными бактериальной микрофлорой, остальные 60 % – дали прирост 0,3‑0,5 см. В последующем побеги были поделены на более мелкие черенки и пересажены на среду без добавления угля, где большая часть растений продолжила наращивать новые побеги. Черенки туи западной, также как и почки ели колючей каждые две недели пересаживались на свежую питательную среду. Было отмечено, что при данном составе культуральной среды у побегов туи западной отсутствует корнеобразование, при этом экспланты, которые долгое время не пересаживались на свежую среду, бурели и отмирали.

В настоящее время эксперимент продолжается, подбираются оптимальные составы питательных сред и условия культивирования.

К современным технологиям повышения устойчивости растений, в том числе полученных технологиями in vitro (в период адаптации к естественным условиям произрастания), может служить инокуляция корневой системы растений микроскопическими симбиотическими грибами. Для этих целей в лаборатории «Экологической безопасности» Удмуртского государственного университета проводятся исследования пределов устойчивости выделенных из естественных условий популяций эндотрофных грибов к действию неблагоприятных факторов и разрабатываются способы использования данных изолятов культур микроскопических грибов для повышения устойчивости растений (через инфицирование ими корневой системы саженцев).

Вывод. Результаты исследований показали, что введение в культуру in vitro вегетативных частей взрослых растений хвойных пород кропотливый и ответственный процесс, требующий специфического подхода к каждому этапу культивирования. Хвойные растения наиболее сложные объекты для культуры in vitro. Все типы тканей и органов у них сильно заражены грибами и бактериями, что значительно затрудняет обеспечение асептики эксплантов [10]. В нашем случае, введение в культуру клеток и тканей ели европейской не дало положительных результатов. Успешно проведено введение в культуру in vitro вегетативных частей растений ели колючей и туи западной, позволяющее при дальнейшем культивировании и размножении получить посадочный материал. Необходимо на основе полученных данных продолжить изучение этого вопроса и подобрать наиболее оптимальные составы питательных сред и групп регуляторов роста растений.

Литература

1. Тимофеева И.В. Опорный конспект лекций по дисциплине «Биотехнология растений». – Павлодар, 2009. – С. 6.
2. Лебедев В.Г., Шестибратов К.А. Органогенез сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в культуре in vitro // Хвойные бореальной зоны. – 2012. – № 1-2. – С. 114-119.
3. Юшкова Е.В. Микроразмножение хвойных в условиях in vitro // Е.В. Юшкова, Е.В. Никонорова, Н.А. Величко и др. // Лесной журнал. – 2001. – № 4. – С. 129-132.
4. Ворошилова Е.В., Третьякова И.Н. Соматический эмбриогенез в культуре мегагаметофитов и зиготических зародышей Pinus sibirica // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: материалы Х международ. конф., 14-18 октября 2013 г. – Казань, 2013. – С. 107.
5. Третьякова И.Н., Белоруссова А.С., Носкова Н.Е. Перспективы применения методов биотехнологии для размножения генетически ценных форм лесных древесных видов // Хвойные бореальной зоны. – 2007. – № 2-3. – С. 309-317.
6. Третьякова И.Н., Пак М.Э., Иваницкая А.С. Микроклональное размножение Larix sibirica и Larix sukaczewii с использованием биотехнологии соматического эмбриогенеза in vitro // Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири: материалы 4-го международ. совещ., 24-29 августа 2015 г. – Барнаул, 2015. – С. 175.
7. Третьякова И. Н., Ворошилова Е. В., Шуваев Д. Н. Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза у гибридных зародышей семян Pinus sibirica // Физиология растений. – 2014. – № 2. – С. 297.
8. Долголиков В.И., Попивший И.И. Положительные стороны и недостатки клоновой селекции ели // Лесоведение, 1992. – № 2. – С. 11–18.
9. Лесные культуры: учеб. пособие / под общ. ред. проф. А.Р. Родина. – Н. Новгород, 2009. – 464 с.
10. Маркова И.А. Современные проблемы лесовыращивания (Лесокультурное производство): уч. пособие. – СПб.: СПбГЛТА, 2008. – 152 с.

References

1. Timofeeva I.V. Opornyj konspekt lekcij po discipline «Biotehnologija rastenij». – Pavlodar, 2009. – S. 6.
2. Lebedev V.G., Shestibratov K.A. Organogenez sosny obyknovennoj (Pinus sylvestris L.) v kul'ture in vitro // Hvojnye boreal'noj zony. – 2012. – № 1-2. – S. 114-119.
3. Jushkova E.V. Mikrorazmnozhenie hvojnyh v uslovijah in vitro // E.V. Jushkova, E.V. Nikonorova, N.A. Velichko i dr. // Lesnoj zhurnal. – 2001. – № 4. – S. 129-132.
4. Voroshilova E.V., Tret'jakova I.N. Somaticheskij jembriogenez v kul'ture megagametofitov i zigoticheskih zarodyshej Pinus sibirica // Biologija kletok rastenij in vitro i biotehnologija: materialy H mezhdunarod. konf., 14-18 oktjabrja 2013 g. – Kazan', 2013. – S. 107.
5. Tret'jakova I.N., Belorussova A.S., Noskova N.E. Perspektivy primenenija metodov biotehnologii dlja razmnozhenija geneticheski cennyh form lesnyh drevesnyh vidov // Hvojnye boreal'noj zony. – 2007. – № 2-3. – S. 309-317.
6. Tret'jakova I.N., Pak M.Je., Ivanickaja A.S. Mikroklonal'noe razmnozhenie Larix sibirica i Larix sukaczewii s ispol'zovaniem biotehnologii somaticheskogo jembriogeneza in vitro // Sohranenie lesnyh geneticheskih resursov Sibiri: materialy 4-go mezhdunarod. soveshh., 24-29 avgusta 2015 g. – Barnaul, 2015. – S. 175.
7. Tret'jakova I. N., Voroshilova E. V., Shuvaev D. N. Kallusogenez i indukcija somaticheskogo jembriogeneza u gibridnyh zarodyshej semjan Pinus sibirica // Fiziologija rastenij. – 2014. – № 2. – S. 297.
8. Dolgolikov V.I., Popivshij I.I. Polozhitel'nye storony i nedostatki klonovoj selekcii eli // Lesovedenie, 1992. – № 2. – S. 11–18.
9. Lesnye kul'tury: ucheb. posobie / pod obshh. red. prof. A.R. Rodina. – N. Novgorod, 2009. – 464 s.
10. Markova I.A. Sovremennye problemy lesovyrashhivanija (Leso-kul'turnoe proizvodstvo): uch. posobie. – SPb.: SPbGLTA, 2008. – 152 s.