ВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТИРОВАННОЙ СУБСТАНЦИИ БИОМАССЫ ЛИСТЬЕВ A. LAPPA L. НА КИНЕТИКУ РОСТА L. PLANTARUM

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.119.5.038

ВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТИРОВАННОЙ СУБСТАНЦИИ БИОМАССЫ ЛИСТЬЕВ A. LAPPA L. НА КИНЕТИКУ РОСТА L. PLANTARUM

Научная статья

Хайбуллин Р.Г.^1, *, Ахмадулина Е.Р.², Волкова Л.В.³

¹ ORCID: 0000-0002-7755-1826;

² ORCID: 0000-0001-8717-6436;

³ ORCID: 0000-0002-7445-5943;

^{1, 2, 3} Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия

* Корреспондирующий автор (ruslan.khaibullin[at]yandex.ru)

Аннотация

Микробная ферментация растительного сырья, в частности, биомассы листьев Arctium lappa L. (лопуха большого), при помощи пробиотических микроорганизмов, позволяет получать на выходе продукт, имеющий в своём составе как полисахарид инулин, содержащийся в растительном сырье, так и экзополисахариды, короткоцепочечные жирные кислоты, бактериоцины и другие бактериальные метаболиты, синтезированные в ходе процесса ферментации. Известно, что приём препаратов, содержащих в своём составе продукты метаболизма пробиотиков, способствует росту и развитию микрофлоры кишечника человека. В связи с этим, проведено исследование влияния экстракта ферментированной субстанции биомассы листьев Arctium lappa L. на кинетику роста L. plantarum для оценки возможного положительного эффекта на микробиоту желудочно-кишечного тракта.

Ключевые слова: ферментированная субстанция, A. lappa L., L. plantarum, кинетика роста, биомасса.

EFFECT OF FERMENTED SUBSTANCE OF A. LAPPA L. LEAF BIOMASS ON GROWTH KINETICS OF L. PLANTARUM

Research article

Hajbullin R.G.^1, *, Ahmadulina E.R.², Volkova L.V.³

¹ ORCID: 0000-0002-7755-1826;

² ORCID: 0000-0001-8717-6436;

³ ORCID: 0000-0002-7445-5943;

^{1, 2, 3} Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russia;

* Corresponding author (ruslan.khaibullin[at]yandex.ru)

Abstract

Microbial fermentation of plant raw materials, in particular, the biomass of  Arctium lappa L. leaves (great burdock), with the help of probiotic microorganisms, produces a product which contains polysaccharide inulin, found in vegetable raw material, as well as exopolysaccharide, short-chain fatty acids, bacteriocins and other bacterial metabolites synthesized in fermentation process. It is known that taking drugs with metabolic products helps the growth and development of the human gut microbiome. Due to this fact, a study of the influence of the fermented substance of the leaf biomass extract of Arctium lappa L. on the growth kinetics of L. plantarum has been conducted to assess the possible positive effect on the human gut microbiome.

Keywords: fermented substance, A. lappa L.,L. plantarum, growth kinetics, biomass.

Введение

Микробная ферментация биомассы листьев лопуха большого (Arctium lappa L.) является перспективным методом получения биологически активных фармацевтических субстанций для их дальнейшего использования в качестве профилактического средства и средства вспомогательной терапии при различных метаболических нарушениях [1]. Известно, что нарушениям метаболизма сопутствует также дисбактериоз кишечника [2], [3], [4], который корректируют при помощи различных препаратов – пробиотиков, пребиотиков и препаратов, содержащих готовые пробиотические метаболиты [5].

Получаемая при помощи микробной ферментации фармацевтическая субстанция биомассы листьев A. lappa L. содержит в себе как инулин, являющийся соединением-пребиотиком, так и бактериальные метаболиты [1]. Таким образом, необходимость проведения оценки влияния полученной субстанции на микроорганизмы, колонизирующие кишечник человека является актуальной задачей для разработки способов её дальнейшего применения.

Методы исследования

Ферментированную фармацевтическую субстанцию получали из биомассы листьев A. lappa L. по разработанной ранее технологии [6]. В качестве тестируемых микроорганизмов использовали вид Lactobacillus plantarum, широко представленный в желудочно-кишечном тракте человека [7]. Предварительно готовили водный экстракт исследуемой субстанции в соотношении 1:10 и проводили его стерилизацию при помощи фильтра Millex-GP, PES, 0.22 мкм (Merck Millipore, USA). Кинетику роста L. plantarum оценивали на жидкой питательной среде МРС-1 [8]. В качестве препарата сравнения использовали препарат «Хилак форте» (MERCKLE GmbH, Германия), содержащий в своём составе кислоты-метаболиты пробиотических микроорганизмов [9]. Жидкую стерильную питательную среду МРС-1 разливали по коническим колбам, объёмом 100 мл, в каждую из которых добавляли исследуемые вещества. План эксперимента представлен в таблице 1.

Таблица 1 – План эксперимента по оценке влияния полученной субстанции на скорость роста микроорганизмов L. plantarum

№ колбы	Питательная среда	Добавка	Кол-во, об. % (мл)
1	МРС-1	- (Контроль)	-
2		Экстракт полученной субстанции 1:10	10
3		Экстракт полученной субстанции 1:10	20
4		«Хилак форте, 30 мл» (MERCKLE GmbH, Германия)	10
5		«Хилак форте, 30 мл» (MERCKLE GmbH, Германия)	20

Далее, в приготовленные колбы добавляли по 1 дозе препарата «Лактобактерин сухой лиоф. 5 доз фл. №10» (АО »Микроген» «Пермское НПО Биомед»), содержащий микробную массу L. plantarum в количестве 2·10⁹ КОЕ в 1 дозе [10]. Колбы укупоривали стерильными пробками и помещали на орбитальный перемешиватель. Культивирование осуществляли при температуре 40 ^оС при 110 об/мин.

Кинетику роста исследуемой культуры оценивали при помощи фотоэлектроколориметра АР-101 (APEL, Япония) на длине волны 600 нм. Значения изменения оптической плотности культуральной жидкости принимали эквивалентными изменению количества биомассы микроорганизмов (D=x). Величину удельной скорости роста (почасовой прирост единицы биомассы) рассчитывали по формуле [11]:

Где: X –биомасса, г; t – время культивирования, ч.

Экспериментальная часть

Измерения оптической плотности культуральной жидкости проводили каждый час в промежутках времени 1 – 6 ч, 24 - 26 ч. Далее, по имеющимся значениям, при помощи ПО Microsoft Excel (Microsoft) провели аппроксимацию путём построения полиномиальных функций для получения математических зависимостей (см. рисунок 1, таблицу 2).

Рис. 1 – Аппроксимированные функции кривых роста культуры L. Plantarum

Таблица 2 – Математические зависимости кинетики роста L. plantarum

Добавка	Математическая зависимость
Контроль	y = 2∙10-7∙x6 - 2∙10-5∙x5 + 0,0009∙x4 - 0,0196∙x3 + 0,1708∙x2 - 0,1618∙x + 1,1414
10 об. % экстракта субстанции	y = -7∙10-6∙x5 + 0,0005∙x4 - 0,0138∙x3 + 0,1277∙x2 - 0,0477∙x + 1,742
20 об. % экстракта субстанции	y = -6∙10-6∙x5 + 0,0004∙x4 - 0,0107∙x3 + 0,098∙x2 - 0,0073x + 2,0864
10 об. % «Хилак Форте»	y = -3∙10-6∙x5 + 0,0002∙x4 - 0,0058∙x3 + 0,0612∙x2 - 0,207∙x + 1,8521
20 об. % «Хилак Форте»	y = 2∙10-6∙x5 - 0,0002∙x4 + 0,0037∙x3 - 0,024∙x2 - 0,0358∙x + 1,8778

Результаты значений недостающих данных оптической плотности и удельной скорости роста, рассчитанные по математическим зависимостям представлены в таблице 3.

Таблица 3 –Полученные данные кинетики роста L. plantarum

t, ч	1			2			3			4			5
	D (x)	ln (100x)	μ, ч-1	D (x)	ln (100x)	μ, ч-1	D (x)	ln (100x)	μ, ч-1	D (x)	ln (100x)	μ, ч-1	D (x)	ln (100x)	μ, ч-1
0	0,031	1,131	-	0,054	1,686	-	0,073	1,988	-	0,060	1,792	-	0,063	1,841	-
1	0,032	1,163	0,032	0,067	1,902	0,216	0,104	2,342	0,354	0,059	1,775	-0,017	0,064	1,856	0,016
2	0,038	1,335	0,172	0,081	2,092	0,190	0,114	2,434	0,092	0,057	1,740	-0,034	0,061	1,808	-0,048
3	0,056	1,723	0,388	0,106	2,361	0,269	0,132	2,580	0,147	0,048	1,569	-0,172	0,051	1,629	-0,179
4	0,091	2,208	0,486	0,161	2,779	0,418	0,191	2,950	0,369	0,049	1,589	0,021	0,043	1,459	-0,171
5	0,146	2,681	0,473	0,265	3,277	0,498	0,304	3,414	0,465	0,056	1,723	0,134	0,041	1,411	-0,048
6	0,232	3,144	0,463	0,434	3,770	0,493	0,467	3,844	0,429	0,068	1,917	0,194	0,044	1,482	0,071
7	0,359	3,580	0,436	0,606	4,104	0,334	0,595	4,086	0,242	0,067	1,897	-0,020	0,039	1,354	-0,127
8	0,520	3,952	0,372	0,846	4,438	0,334	0,784	4,362	0,277	0,071	1,956	0,059	0,038	1,336	-0,018
9	0,705	4,256	0,304	1,105	4,705	0,267	0,981	4,586	0,224	0,074	1,999	0,043	0,038	1,344	0,007
10	0,890	4,489	0,233	1,345	4,902	0,196	1,159	4,753	0,167	0,076	2,022	0,023	0,040	1,375	0,031
11	1,049	4,653	0,164	1,526	5,028	0,126	1,296	4,864	0,111	0,076	2,025	0,003	0,042	1,426	0,052
12	1,161	4,755	0,102	1,623	5,089	0,061	1,374	4,923	0,059	0,075	2,009	-0,016	0,045	1,495	0,069
13	1,220	4,804	0,049	1,631	5,094	0,005	1,393	4,937	0,013	0,072	1,976	-0,033	0,048	1,576	0,081
14	1,229	4,811	0,007	1,566	5,054	-0,041	1,360	4,913	-0,024	0,069	1,930	-0,046	0,053	1,663	0,088
15	1,202	4,789	-0,022	1,454	4,980	-0,074	1,292	4,861	-0,051	0,065	1,876	-0,054	0,058	1,752	0,089
16	1,154	4,748	-0,041	1,325	4,886	-0,093	1,207	4,793	-0,068	0,062	1,817	-0,059	0,063	1,837	0,085
17	1,100	4,700	-0,048	1,199	4,787	-0,100	1,119	4,718	-0,075	0,058	1,759	-0,058	0,068	1,913	0,076
18	1,050	4,654	-0,046	1,091	4,692	-0,094	1,041	4,645	-0,072	0,055	1,705	-0,054	0,072	1,975	0,062
19	1,012	4,617	-0,037	1,001	4,606	-0,086	0,968	4,573	-0,073	0,052	1,649	-0,056	0,075	2,015	0,040
20	0,987	4,592	-0,025	0,955	4,559	-0,047	0,937	4,540	-0,033	0,051	1,624	-0,024	0,077	2,047	0,032
21	0,978	4,583	-0,010	0,930	4,532	-0,027	0,915	4,516	-0,024	0,050	1,602	-0,023	0,078	2,054	0,007
22	0,981	4,586	0,004	0,930	4,532	0,000	0,912	4,513	-0,003	0,049	1,590	-0,012	0,077	2,042	-0,012
23	0,994	4,599	0,012	0,949	4,553	0,021	0,925	4,527	0,014	0,049	1,587	-0,003	0,075	2,015	-0,027
24	1,018	4,623	0,024	0,994	4,599	0,046	0,961	4,565	0,038	0,050	1,611	0,024	0,072	1,974	-0,041
25	1,009	4,614	-0,009	0,986	4,591	-0,008	0,956	4,560	-0,005	0,048	1,569	-0,043	0,071	1,960	-0,014
26	1,001	4,606	-0,008	0,981	4,586	-0,005	0,946	4,550	-0,011	0,048	1,569	0,000	0,067	1,902	-0,058

На основании рассчитанных данных построили кривые роста исследуемой культуры и кривые накопления биомассы в питательной среде (см. рисунок 2, 3).

Рис. 3 – Кривые накопления биомассы в исследуемой культуре L. Plantarum

Из полученных табличных и графических данных можно сделать вывод, что при добавлении в среду экстракта ферментированной при помощи микроорганизмов субстанции биомассы листьев A. lappa L., рост культуры L. plantarum на жидкой питательной среде МРС-1 интенсифицируется, в особенности при использовании 10 % экстракта субстанции в качестве ростовой добавки, при этом максимальная удельная скорость роста составила 0,498 ч^-1 (см. таблицу 2).

Также при добавлении 10% и 20% экстракта наблюдали отсутствие лаг-фазы, в отличие от контрольного образца, что объясняется высокой адаптацией культивируемых микроорганизмов к добавляемым факторам роста. Однако, наступление фазы замедления и стационарной фазы происходит быстрее в связи с интенсивным ростом культуры и потреблением питательных веществ из окружающей среды.

Добавление в питательную среду препарата «Хилак Форте» показало отрицательное влияние на рост L. plantarum ввиду большой концентрации содержащихся в препарате кислот-метаболитов, что, в используемом объёме питательной среды, оказало угнетающий эффект на растущую колонию.

Заключение

Было изучено влияние экстракта ферментированной фармацевтической субстанции биомассы листьев A. lappa L на кинетику роста культуры L. plantarum на жидкой питательной среде МРС-1. Полученные результаты показали, что добавление 10 % и 20 % экстракта оказывает положительный эффект при культивировании L. plantarum, повышая скорость накопления биомассы по сравнению с культурой L. plantarum, культивируемой на питательной среде без добавок. Используемый препарат сравнения «Хилак Форте» в заданных экспериментальных условиях не проявил специфическую активность за счёт высоких концентраций кислот в своём составе, оказывающих угнетающее действие на культуру бактерий. Таким образом, полученный результат может свидетельствовать о наличии пребиотической активности у изучаемой ферментированной фармацевтической субстанции, что может предполагать её дальнейшее использование в качестве профилактического средства в коррекции нарушений баланса микробиоты кишечника.

Конфликт интересов	Conflict of Interest
Не указан.	None declared.

Список литературы / References

1. Хайбуллин Р.Г. Перспективы получения биологически активных субстанций из биомассы растений методом микробной ферментации (обзор) / Р.Г. Хайбуллин, Л.В. Волкова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2021; 4: 3−12;
2. Qin, J. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes / J. Qin, Y. Li, Z. Cai, et al.//  – 2012, 490: 55–60;
3. Baothman, O.A. The role of Gut Microbiota in the development of obesity and Diabetes / O.A. Baothman, A. Zamzami, I. Taher, et al. // Lipids in Health and Disease. - 2016 15: 108;
4. Tai, N. The role of gut microbiota in the development of type 1, type 2 diabetes mellitus and obesity / N. Tai, S. Wong, L. Wen // Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. – 2015, 16: 55–65;
5. Ардатская М. Д. Пробиотики, пребиотики и метабиотики в коррекции микроэкологических нарушений кишечника / М. Д. Ардатская. // Медицинский совет. – 2015. 13: 94-99;
6. Патент № 2733141 (РФ). Способ получения фитокомпозиции/ Волкова Л.В., Хайбуллин Р.Г.; заявитель и патентообладатель Пермский национальный исследовательский политехнический университет. - № 2019119049: заявл. 06.2019: опубл. 29.09.2020. - 6 с;
7. Lactobacillus plantarum // Функциональная гастроэнтерология : [Электронный ресурс]. – URL: https://www.gastroscan.ru/handbook/118/5612/ (дата обращения: 20.04.2022);
8. ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков // Фармакопея.рф : [Электронный ресурс]. – URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-2-0009-15-opredelenie-spetsificheskoj-aktivnosti-probiotikov/ (дата обращения: 20.04.2022);
9. Хилак форте. Описание препарата в справочнике Видаль // Vidal. Cправочник лекарственных средств : [Электронный ресурс]. – URL: https://www.vidal.ru/drugs/hylak-forte-2/ (дата обращения: 20.04.2022);
10. Лактобактерин сухой. Описание препарата в справочнике Видаль // Vidal. Cправочник лекарственных средств : [Электронный ресурс]. – URL: https://www.vidal.ru/drugs/lactobacterin_dry__36454/ (дата обращения: 20.04.2022);
11. Виноградова, А. В. Культивирование микроорганизмов: Учеб. пособие / А. В. Виноградова, Г. А. Козлова. – Пермь : ПНИПУ, 2012. – 97 c.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Khaibullin R.G. Perspektivy poluchenija biologicheski aktivnyh substancij iz biomassy rastenij metodom mikrobnoj fermentacii (obzor) [Perspectives for production plant biomass biologically active product by the microbial fermentation method (review)] / R.G. Khaibullin, L.V. Volkova // Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. [Problems of biological medical and pharmaceutical chemistry] - 2021; 4: 3−12; [in Russian]
2. Qin, J. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes / J. Qin, Y. Li, Z. Cai, et al.//  – 2012, 490: 55–60;
3. Baothman, O.A. The role of Gut Microbiota in the development of obesity and Diabetes / O.A. Baothman, A. Zamzami, I. Taher, et al. // Lipids in Health and Disease. - 2016 15: 108;
4. Tai, N. The role of gut microbiota in the development of type 1, type 2 diabetes mellitus and obesity / N. Tai, S. Wong, L. Wen // Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. – 2015, 16: 55–65;
5. Ardatskaya M. D. Probiotiki, prebiotiki i metabiotiki v korrekcii mikroekologicheskih narushenij kishechnika [Probiotics, prebiotics and metabiotics in the microecological intestine disorders correction] / M. D. Ardatskaya. // Medicinskij sovet. [Medical advice] – 2015. 13: 94-99; [in Russian]
6. № 2733141 Russian Federation. Sposob poluchenija fitokompozicii / Volkova L.V., Hajbullin R.G.; The applicant and the patentee Perm national research polytechnic university - № 2019119049: appl. 06/18/19: publ. 29.09.20. - 6 p.;
7. Lactobacillus plantarum // Funkcional'naya gastroenterologiya [Functional gastroenterology]: [Electronic resource]. – URL: https://www.gastroscan.ru/handbook/118/5612/ (accessed: 20.04.2022); [in Russian]
8. 1.7.2.0009.15 Opredelenie specificheskoj aktivnosti probiotikov. [Pharmacopoeia article 1.7.2.0009.15 Determination of the specific activity of probiotics] // Farmakopeja.rf: [Electronic resource]. – URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-2-0009-15-opredelenie-spetsificheskoj-aktivnosti-probiotikov/ (accessed: 20.04.2022); [in Russian]
9. Hylak forte. Opisanie preparata v spravochnike Vidal' [Hylak forte. Description of the drug in the Vidal reference book] // Vidal. Spravochnik lekarstvennyh sredstv [Vidal. Directory of medicines] : [Electronic resource]. – URL: https://www.vidal.ru/drugs/hylak-forte-2/ (accessed: 20.04.2022); [in Russian]
10. Laktobakterin suhoj. Opisanie preparata v spravochnike Vidal' [Lactobacterin dry. Description of the drug in the Vidal reference book] // Vidal. Spravochnik lekarstvennyh sredstv [Vidal. Directory of medicines] : [Electronic resource]. – URL: https://www.vidal.ru/drugs/lactobacterin_dry__36454/ (accessed: 20.04.2022); [in Russian]
11. Vinogradova, A. V. Kul'tivirovanie mikroorganizmov: Ucheb. Posobie [Cultivation of microorganisms: Textbook] / V. Vinogradova, G. A. Kozlova. - Perm : PNIPU, 2012. - 97 p. [in Russian]