СПОСОБ СОЗДАНИЯ КОЛЛЕКЦИИ ГЕНОФОНДА ВИНОГРАДА IN VITRO

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.119.5.007

СПОСОБ СОЗДАНИЯ КОЛЛЕКЦИИ ГЕНОФОНДА ВИНОГРАДА IN VITRO

Научная статья

Дорошенко Н.П.¹, Пузырнова В.Г.^2, *

¹ ORCID: 0000-0002-7284-120X;

² ORCID: 0000-0003-3930-1639;

^{1, 2} Всероссийский научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия имени Я.И. Потапенко, Новочеркасск, Россия

* Корреспондирующий автор (ruswinebooks[at]yandex.ru)

Аннотация

Актуальность заключается в разработке нового способа формирования коллекции и повышении эффективности хранения растений винограда в условиях медленно растущей коллекции in vitro. Исследования проведены на сортах винограда Каберне Совиньон, Платовский, Фиолетовый ранний по общепринятым в биотехнологии и усовершенствованным для культуры винограда методикам. Результаты проведенной работы состоят, в первую очередь, в выборе исходного экспланта из пробирочных растений, предварительно оздоровленных через культуру апикальных меристем. Следующим этапом создания коллекции является подготовка к хранению на питательной среде с антибиотиком Цефотаксим, концентрация которого составляет 50,0–450,0 мг/л в зависимости от степени инфицирования растений. Выявлено, что место расположения микрочеренков оказывает влияние на приживаемость, кинетику ростовых процессов и продолжительность беспересадочного хранения растений. Доказано, что у растений сортов Каберне Совиньон, Платовский, Фиолетовый ранний продолжительность беспересадочного хранения растений, выделенных из микрочеренков нижней, средней и верхней части побегов, значительно различается. Сохранность растений в коллекции и продолжительность беспересадочного хранения, увеличивается до 10,0 и более месяцев у растений, полученных из глазков верхних частей побегов, что в 1,7 раза превышает эти показатели у растений, полученных из микрочеренков средней и нижней части побегов. Предварительное оздоровление растений и выбор места расположения микрочеренков (верхняя часть побега) обеспечивают беспересадочное хранение растений в коллекции в течение 10–12 месяцев. При этом отменяется необходимость модификации питательных сред, применения в их составе большого количества регуляторов роста. Благодаря снижению трудозатрат и затрат на приобретение дорогостоящих реактивов, повышается экономическая эффективность формирования коллекции in vitro и депонирования в ней винограда в виде медленно растущих растений.

Ключевые cлова: сохранение генофонда in vitro, исходный материал, Цефотаксим, разнокачественность глазков, кинетика ростовых процессов, увеличение продолжительности беспересадочного культивирования.

METHOD FOR CREATING GRAPE GENE POOL COLLECTION IN VITRO

Research article

Doroshenko N.P.¹, Puzyrnova V.G.^2, *

¹ ORCID: 0000-0002-7284-120X;

² ORCID: 0000-0003-3930-1639;

^{1, 2} All-Russian Research Institute of Viticulture and Winemaking named after Y.I. Potapenko, Novocherkassk, Russia

* Corresponding author (ruswinebooks[at]yandex.ru)

Abstract

The research relevance lies in the development of a new way of forming a collection and increasing the efficiency of grape plants storage of a collection slowly growing in vitro. The research was carried out on varieties of Cabernet Sauvignon, Platovsky and Purple early grapes in accordance with techniques applied in biotechnology and improved for grape culture. The results of the work consist, first of all, in the choice of the original explant from in vitro plants, which has been previously sanitized through the apical meristems culture. The next stage in the collection development is preparation for its storage on a growing medium with antibiotic of Cefotaxime, the concentration of which should be 50.0-450.0 mg/l depending on the degree of infection of plants. It was established that the location of microshafts influences the acclimatization, growth kinetics and the duration of seed-to-seed plants storage. It was determined that the varieties of Cabernet Sauvignon, Platovsky and Purple early have different seed-to-seed period duration between their microshafts of lower, middle and upper parts of cuts. The preservation of plants in the collection and the duration of safe seed-to-seed period is increased to 10.0 or more months in plants derived from the eyes of the upper parts of cuts, which is 1.7 times higher than that in plants, derived from microshafts of the middle and lower parts of cuts. Pre-sanitation of plants and selection of the microshaft part (the upper one of the cuts) ensure safe keeping of plants collection for 10-12 months. This eliminates the need to modify growing medium, to use of a large number of growth regulators in their composition. By reducing the labor costs and the cost of purchasing expensive reagents, it became cost-effective to form an in vitro collection and deposit grapes in a form of slow-growing plants.

Keywords: genetic conservation, in vitro, starting material, Cefotaxime, eye differing, growth rate kinetics, increase of seed-to-seed duration.

Введение

Сохранение разнообразия форм жизни – важнейшая проблема современного человечества, которая стала актуальной в связи с тем, что в условиях глобального экологического неблагополучия большое число видов растений находятся под угрозой исчезновения.

Наряду с традиционными способами сохранения биоразнообразия растительного мира, всё большее значение для этих целей приобретает использование культуры изолированных тканей и органов. Методы культивирования in vitro позволяют создать биотехнологию хранения генофонда при замедленном росте этих объектов. В связи с этим разработка и совершенствование методов биотехнологии актуально для использования в системе сохранения и воспроизводства ресурсов [1], [2], [3].

Сохранение генофонда дикорастущего и аборигенного евразийского винограда от интенсивно проходящей "эрозии генов" – мировая общепризнанная проблема, решаемая европейским сообществом ампелографов под патронажем Международного центра генетических ресурсов растений [4].

Исследования по винограду в этом направлении [5], [6], [7], [8] начатые в 1979–1987гг., не утратили своей актуальности, а, наоборот, получают своё дальнейшее развитие [9], [10], [14], [15]. Замедление роста обычно достигается за счет модификации сред или условий культивирования. Модификации сред включают разбавление минеральной основы, снижение содержания сахарозы, изменение концентраций или комбинаций регуляторов роста, добавление осмотически активных веществ. Из физических факторов культивирования снижают температуру в комбинации с уменьшением интенсивности освещения, а иногда культуры хранят в полной темноте.

При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях роста (t=20÷25°С), возникает необходимость частого переноса растений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может приводить к возникновению сомаклональных вариантов.

Целью настоящего исследования является разработка способа формирования коллекции и длительного депонирования винограда, позволяющего за счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат, исключения дорогостоящих реактивов повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro и сохранность генетической стабильности образцов.

Материалы и методы

Исследования проведены по общепринятым в биотехнологии методикам [16], [17], [18], [19] на питательной среде Мурасиге и Скуга, модифицированной для каждого этапа культивирования.

В качестве исходных отбирали пробирочные хорошо развитые растения с прямыми стеблями, зелеными листьями, без утончения и почернения корней, укороченных междоузлий, ветвистости и суховершинности, с питательной средой в пробирках без пятен молочного цвета в среде, темных пятен на поверхности питательной среды.

Перед использованием этих растений для создания генофонда они были введены в культуру in vitro в виде апикальных меристем размером 0,1–0,2 мм и осуществлена регенерация растений на этапах собственно микроразмножения и микрочеренкования.

Для оздоровления от микоплазменной инфекции растения, восстановленные из меристем, черенковали и высаживали на питательную среду Мурасиге и Скуга. В состав среды вводили антибиотик Цефотаксим, концентрация которого колебалась в от 50 до 450 мг/л в зависимости от степени инфицирования растений.

Для постановки на хранение растения, выросшие на питательной среде с Цефотаксимом, разделяли на верхнюю, среднюю, нижнюю части и черенковали. Размер микрочеренка 10–12 мм с глазком. Микрочеренки высаживали на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга и культивировали в стандартных условиях при температуре 22–25⁰ С и освещенности 2000 лк.

Показатели, учитываемые при регенерации и сохранении растений: приживаемость, гибель от инфекции, гибель из-за отсутствия развития, число корней, длина корней, ризогенная зона, высота, количество листьев всего и на 1 см побега, скорость роста, коэффициент полярности.

Исследования проводили на сортах винограда Каберне Совиньон, Платовский, Фиолетовый ранний.

Обсуждение полученных результатов

Исследования, проведенные нами на целом ряде сортов, показали, что при слабом инфицировании применение антибиотика улучшает приживаемость растений на 5,0–15,0 % по сравнению с контролем. В данном случае эффективны низкие концентрации Цефотаксима 50–250мг/л. При заражении от 15,0 до 50,0% растений эффективность применения Цефотаксима возрастает: приживаемость микрочеренков увеличивается по сравнению с контролем на 35,0–45,0%. При этом эффективны концентрации 250–450 мг/л. При сильной степени инфицирования (выше 50,0%) наиболее четко проявляется деконтаминация растений при всех концентрациях антибиотика. Лучшие результаты оздоровления получены при концентрациях 350–450 мг/л.

Подготовка к хранению с предварительным оздоровлением на питательной среде с антибиотиком Цефотаксим является новым элементом способа.

Выявлено на сортах Фиолетовый ранний, Платовский, Каберне Совиньон, что место расположения микрочеренков оказывает влияние на приживаемость, кинетику ростовых процессов и продолжительность беспересадочного хранения растений.

У сорта Фиолетовый ранний растения, полученные из верхней части побегов, при стопроцентной приживаемости, сохранились в течение 341суток (таблица 1), в то время как растения из нижней части побегов сохранились лишь 117 суток, а растения из средней части побегов 147 суток. При этом следует отметить умеренное развитие ризогенной зоны, побегов, облиственности и сочетания развития корней и побегов у растений из верхней части побегов.

Выявлено слабое развитие растений, восстановленных из нижней части побегов пробирочных растений. Произошло лишь образование корней и незначительный их рост. Полностью отсутствовал рост побегов. Отсутствие развития надземной части привело к полной гибели растений уже на 117 день культивирования. Это следует учитывать при массовом тиражировании растений при клональном микророазмножении.

Растения, регенерированные из средней части побегов, имели более развитую ризогенную зону, за счет образования большего числа корней, в сравнении с растениями из нижней части Кроме этого, выявлено лучшее развитие надземной части растений по высоте и облиственности побегов, которое сохранялось в течение 147 дней культивирования. Затем скорость роста растений замедлилась в 2 раза, растения начали подсыхать и через 147 дней культивирования произошла их полная гибель.

Таблица 1 – Рост и развитие растений, выделенных из глазков разных частей побегов, сорт Фиолетовый ранний, 2019-2020 гг.

Часть побега	Гибель, %		Приживаемость, %	Корни			Высота, см	Число листьев, шт		Скорость роста, мм/ сутки	Коэффициент полярности
	ГИ	ОР		число, шт	длина, см	ризогенная зона, см		всего	на 1 см побега
39 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,0	1,0	3,0	2,0	1,0	0,5	0,5	1,5
Средняя	0	0	100	2,5	0,8	2,0	2,5	2,0	0,8	0,6	0,8
Нижняя	0	0	100	1,0	0,3	0,3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
75 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,0	2,9	8,7	3,0	3,0	1,0	0,4	2,9
Средняя	0	0	100	2,5	0,9	2,3	4,3	5,0	1,2	0,6	0,5
Нижняя	0	0	100	1,5	2,7	4,1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
117 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,0	2,8	8,4	3,5	5,0	1,4	0,3	2,4
Средняя	0	0	100	4,0	0,8	3,2	4,3	4,9	1,1	0,4	0,7
Нижняя	0	100	0
147 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,0	2,6	7,8	5,0	8,0	1,6	0,3	1,6
Середина	0	0	100	5,5	1,0	5,5	5,0	6,5	1,3	0,3	1,1
230 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	4,0	2,4	9,6	6,0	9,0	1,5	0,3	1,6
Средняя	0	100	0
280 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,5	2,8	9,8	6,0	9,0	1,5	0,2	1,6
313 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,0	3,3	9,3	6,2	8,0	1,3	0,2	1,5
341 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	3,0	3,1	9,9	7,0	8,0	1,1	0,2	1,4

Для растений, регенерированных из глазков верхней части побегов, характерно гармоничное развитие как ризогенной зоны, так и побегов. На это указывает коэффициент полярности (отношение ризогенная зона / высота растения), который был высоким в этом варианте, как на начальных этапах (75–117 дней), так и в течение всего периода культивирования. Считаем, что это обеспечило продолжительное (341 суток) беспересадочное культивирование растений.

Несколько иное положение сложилось у растений сорта Платовский, полученных из микрочеренков разной части побегов (таблица 2).

Таблица 2 – Рост и развитие растений, выделенных из разных частей побегов, сорт Платовский, 2019-2020 гг.

Часть побега	Гибель, %		Приживаемость, %	Корни			Высота, см	Число листьев, шт		Скорость роста, мм/ сутки	Коэффициент полярности
	ГИ	ОР		число, шт	длина, см	ризогенная зона, см		всего	на 1 см побега
39 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	2,0	0,8	1,6	0,3	0,3	1,0	0,1	5,3
Средняя	0	0	100	4,0	1,1	4,4	1,2	1,0	0,8	0,3	3,7
Нижняя	0	0	100	3,0	0,7	2,1	0,5	0,5	1,0	0,1	4,2
75 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	2,0	1,2	2,4	1,0	1,3	1,3	0,1	2,4
Средняя	0	0	100	4,0	1,7	6,8	1,8	2,3	1,3	0,2	3,8
Нижняя	0	25,0	75,0	4,3	2,1	9,0	2,2	2,0	0,9	0,3	4,1
117 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	4,0	1,5	6,0	2,0	3,3	1,7	0,2	3,0
Средняя	0	66,7	33,3	3,0	3,0	9,0	6,0	9,0	1,5	0,5	1,5
Нижняя	0	75,0	25,0	6,0	4,1	24,6	11,5	9,0	0,8	1,0	2,1
147 дней культивирования
Верхняя	0	66,7	33,3	3,0	2,2	6,6	5,0	9,0	1,8	0,3	1,3
Средняя	0	66,7	33,3	4,0	2,4	9,6	6,5	8,0	1,2	0,4	1,5
Нижняя	0	75,0	25,0	7,0	4,1	28,7	12,0	9,0	0,8	0,8	2,4
230 дней культивирования
Верхняя	0	66,7	33,3	4,0	2,8	11,2	5,0	10,0	2,0	0,2	2,2
Средняя	0	66,7	33,3	4,0	3,2	12,8	6,5	10,0	1,5	0,3	2,0
Нижняя	0	75,0	25,0	7,0	3,8	26,6	12,0	9,0	0,8	0,5	2,2
280 дней культивирования
Верхняя	0	66,7	33,3	4,0	3,5	14,0	5,0	10,0	2,0	0,2	2,8
Средняя	0	100	0
Нижняя	0	100	0
330 дней культивирования
Верхняя	0	100	0

 

Растения, полученные из глазков нижней части побегов, отличались интенсивным развитием ризогенной зоны на протяжении всего периода культивирования (230 суток). Побеги отставали в развитии, особенно в первые 75 дней культивирования Высокий коэффициент полярности подтверждает преимущественное развитие корневой системы – 4,1–4,2. В это время у растений отмечается очень низкая скорость роста: 0,1–0,3 см/сутки, значительная часть растений останавливается в росте и погибает. У оставшихся растений резко возрастает скорость роста до 0,8–1,0 см/ сутки, происходит интенсивный рост растений, корневая система не справляется с обеспечением их питанием и растения погибают.

У растений, регенерированных из глазков средней части побегов, в первые 75 дней культивирования преобладало развитие ризогенной зоны над развитием побегов: коэффициент полярности составлял 3,7–3,8. Это привело к отсутствию развития и гибели 66,7% растений. Оставшиеся в живых растения были более сбалансированными и сохранились живыми в течение 230 дней.

Умеренное развитие ризогенной зоны, побегов и скорости роста отмечено у растений, полученных из глазков верхней части побегов, что позволило сохранится живыми 33,3% растений до 280 дней беспересадочного культивирования.

Лучшая приживаемость, образование корней и сохранность растений сорта Каберне Совиньон (таблица 3) отмечена на протяжении всего периода культивирования у микрочеренков, выделенных из верхней части побегов. Продолжительность их беспересадочного культивирования составила 375 дней. Причем у сохранившихся растений наблюдался достаточно высокий потенциал, который можно использовать при перезакладке коллекции.

Таблица 3 – Рост и развитие растений, выделенных из разных частей побега, сорт Каберне Совиньон, 2019-2020 гг.

Часть побега	Гибель, %		Приживаемость, %	Корни			Высота, см	Число листьев, шт		Скорость роста, мм/ сутки	Коэффициент полярности
	ГИ	ОР		число, шт	длина, см	ризогенная зона, см		всего	на 1 см побега
39 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	5,3	0,9	4,8	2,0	1,5	0,8	0,5	2,4
Средняя	0	0	100	5,3	0,9	4,8	2,5	1,2	0,5	0,6	1,9
Нижняя	0	0	100	4,8	1,1	5,3	2,6	2,1	0,8	0,7	2,0
75 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	5,5	1,2	6,6	5,0	4,3	0,9	0,7	1,3
Средняя	0	0	100	5,5	1,4	7,7	8,2	4,8	0,6	1,1	0,9
Нижняя	0	15,4	84,6	5,1	1,4	7,1	6,3	4,3	0,7	0,8	1,1
117 дней культивирования
Верхняя	0	0	100	6,0	1,3	7,8	6,2	5,5	0,9	0,5	1,3
Средняя	0	16,7	83,3	5,6	1,6	9,0	9,9	6,9	0,7	0,8	0,9
Нижняя	0	23,1	61,5	4,1	1,5	6,2	9,9	7,7	0,8	0,8	0,6
147 дней культивирования
Верхняя	0	9,1	90,9	6,6	1,6	10,6	6,9	6,1	0,9	0,5	1,5
Средняя	0	25,0	75,0	7,2	1,6	11,5	10,8	8,8	0,8	0,7	1,1
Нижняя	0	23,1	61,5	5,4	2,0	10,8	9,9	8,5	0,9	0,6	1,2
230 дней культивирования
Верхняя	0	45,5	54,5	6,8	2,5	17,0	7,2	6,8	0,9	0,3	2,4
Средняя	0	91,7	8,3	7,0	1,8	12,6	10,0	9,0	0,9	0,4	1,3
Нижняя	0	69,2	30,8	5,0	3,0	15,0	10,0	8,0	0,8	0,4	1,4
280 дней культивирования
Верхняя	0	72,7	27,3	5,3	2,6	13,8	5,5	5,3	1,0	0,2	2,5
Средняя	0	100	0
Нижняя	0	92,3	7,7	5,0	3,2	16,0	9,5	7,0	0,7	0,3	1,7
313 дней культивирования
Верхняя	0	81,8	18,2	5,3	2,6	13,7	6,8	9,5	1,4	0,2	2,0
Средняя	0	100	0
Нижняя	0	100	0
341 дней культивирования
Верхняя	0	81,8	18,2	5,3	2,7	14,3	7,5	9,0	1,2	0,2	1,7
Средняя	0	100	0
Нижняя	0	100	0
375 дней культивирования
Верхняя	0	90,9	9,1	5,0	1,9	9,5	10,0	9,0	0,9	0,3	1,0

Доказано, что у растений сортов Каберне Совиньон, Платовский, Фиолетовый ранний продолжительность беспересадочного хранения растений, выделенных из микрочеренков нижней, средней и верхней части побегов, значительно различается (таблица 4). Сохранность растений в коллекции и продолжительность беспересадочного хранения, увеличивается до 10,0 и более месяцев у растений, полученных из глазков верхних частей побегов, что в 1,7 раза превышает эти показатели у растений, полученных из микрочеренков средней и нижней части побегов.

Таблица 4 – Продолжительность беспересадочного культивирования in vitro растений изучаемых сортов винограда из различных частей побегов

Часть побега	Продолжительность (дней/ месяцев) беспересадочного культивирования растений сортов			В среднем по трем сортам
	Фиолетовый ранний	Платовский	Каберне Совиньон	дней	месяцев
Верхняя	341 / 11,3	280 /9,3	375 /12,5	332,0	11,0
Средняя	147 /4,9	230 /7,6	230 / 7,6	202,3	6,7
Нижняя	75/ 2,5	230 / 7,6	280 / 9,3	195,0	6,5

Заключение

Таким образом, на основании проведенных исследований, разработан способ хранения растений винограда [20] в условиях медленно растущей «зеленой» коллекции in vitro, который включает:

– использование в качестве исходных пробирочные растения, предварительно оздоровленные при помощи культуры апикальных меристем размером 0,1–0,2 мм;

– подготовку к хранению на этапе микроразмножения на питательной среде МС, содержащей Цефотаксим;

– высадку на хранение микрочеренков растений, выделенных из верхних частей побегов и осуществление культивирования в коллекции in vitro на твердой питательной среде Мурасиге Скуга без гормонов.

Предварительное оздоровление растений и выбор места расположения микрочеренков (верхняя часть побега) обеспечивают беспересадочное хранение растений в коллекции в течение 10–12 месяцев. При этом отменяется необходимость модификации питательных сред, применения в их составе большого количества регуляторов роста. Благодаря снижению трудозатрат и затрат на приобретение дорогостоящих реактивов, повышается экономическая эффективность формирования коллекции in vitro и депонирования в ней винограда в виде медленно растущих растений.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Сохранение редких и исчезающих видов растений при помощи методов биотехнологии / О.О. Жолобова, О.И. Коротков, Г.Н.Сафронова и др. // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 1.
2. Новикова Т.И. Использование биотехнологических подходов для сохранения биоразнообразия растений / Т.И. Новикова // Растительный мир Азиатской России. – 2013. – № 2(12). – с. 119-128.
3. Сохранение редких видов растений в генетических коллекциях in vitro / Е.М. Ветчинкина, И.В. Ширнина, С.Ю. Ширнин и др. // Вестн. Балтийского фед. ун-та им. И.Канта. – 2012. – № 7. – С. 109-118.
4. Biotechnology and Conservation of Plant Biodiversity / Cruz-Cruz C.A., Gonzalez-Arnao M. Teresa and Engelmann F // Resources –2013. – No. 2. – 73–95.
5. Clonal propagation in trough tissbt culture/ M.Barlass K.G.V., K.G.M Skene // Austral Grapegrower and Winemacer – 1979. – No. 16(91). – P. 12-13.
6. Galzy R. Les possibilities de conservation in vitro d^’ une collection de clones de vignes /R. Galzy // Bulletin de I.O.I.V. – 1985. – P.378-390.
7. Blaich R. Investigation on meristem and organ cultures in vitro for selection and conservation of genotypes of the grapevine. / R. Blaich // Bulletin de L: O.I.V. – 1985. – No. 58. – pp. 391-395.
8. Der Einflus von in vitro wachtux nisinhibitoren auf dieangzeit-lagerund von in vitro Kulturen der Rebe/ G. Alleweldt, M.Harst-Langenbucher // Vitis. – 1987. – No. 26,2. – P. 57-64.
9. Technical guidelines for the management of field and in vitro germplasm collections / B.M. Reed, F. Engelmann, M.E. Dulloo, et al. // IPGRI Handbooks for Genebanks No. 7. Int. Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. – 2004.
10. Tehrim S. In vitro establishment, conservation and its implications for grape germplasm biodiversity. / G.M. Sajid, S. Tehrim // Romanian Biotechnol. Lett. – 2011. – No. 16(6). – pp. 6785-6789.
11. In vitro techniques for grapevine germplasm conservation / D. Bosco, I. Sinski, V. Comachio et al. // ActaHortic. – 2015. – No. 1082. – pp. 201-205.
12. Micro propagation and in vitro germplasm conservation of Georgian wild grapevines / D. Maghradze, R. Ocete, J.L. Garcia et al. // Vitis. – 2015. – № 54. – pp. 246–248
13. Дорошенко Н.П. Создание и хранение коллекции винограда in vitro / Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова // Русский виноград. – 2016. – T.3 – С.8- 14.
14. Полулях А.А. Генетические ресурсы винограда института «Магарач». Проблемы и перспективы сохранения / А.А.Полулях, В.А.Волынкин, В.В. Лиховской // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2017. – No. 21(6). – С. 608-616. DOI 10.18699/VJ17.
15. Doroshenko N. Biotechnological methods of preservation of the grape gene pool in the in vitro collection / N. Doroshenko, V. Puzirnova // BIO Web Conf. – 2020. – № 25. – 04001. DOI: 10.1051/bioconf/20202504001.
16. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П.Я. Голодрига и др. // ВНИИВиПП «Магарач». – Ялта, 1986. – 56 с.
17. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro, и биотехнология на их основе / Р. Г. Бутенко – М., 1999.
18. Дорошенко Н.П. Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа: Рекомендации / Н.П.Дорошенко. – М., 1998. – 24 с.

19. Дорошенко Н.П. Клональное микроразмножение винограда: Рекомендации / Н.П. Дорошенко. – Новочеркасск: Изд-во ГНУ ВНННВиВ им.Я.И. Потапенко, 2012.
20. Патент RU 2764104 C 1.2022. Н.П. Дорошенко, В.Г. Пузырнова Способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Sokhraneniye redkikh i ischezayushchikh vidov rasteniy pri pomoshchi metodov biotekhnologii [Preservation of rare and endangered plant species using biotechnology methods] / O.O. Zholobova. O.I. Korotkov. G.N. Safronova et al. // Sovremennyye problemy nauki i obrazovaniya [Modern problems of science and education]. – 2012. – № 1. [in Russian]
2. Novikova T.I. Ispolzovaniye biotekhnologicheskikh podkhodov dlya sokhraneniya bioraznoobraziya rasteniy [The use of biotechnological approaches for the conservation of plant biodiversity] /T.I. Novikova // Rastitelnyy mir Aziatskoy Rossii [Flora of Asian Russia]. – 2013. – № 2(12). – pp. 119-128. [in Russian]
3. Sokhraneniye redkikh vidov rasteniy v geneticheskikh kollektsiyakh in vitro [Preservation of rare plant species in genetic collections in vitro] / E.M. Vetchinkina. I.V. Shirnina. S.Yu. Shirnin et al. // Vestn. Baltiyskogo fed. un-ta im. I. Kanta [Vestn. Baltic Fed. I. Kant University]. – 2012. – № 7. – pp. 109-118. [in Russian]
4. Biotechnology and Conservation of Plant Biodiversity / Cruz-Cruz C.A., Gonzalez-Arnao M. Teresa and Engelmann F // Resources –2013. – No. 2. – 73–95.
5. Clonal propagation in trough tissbt culture/ M.Barlass K.G.V., K.G.M Skene // Austral Grapegrower and Winemacer – 1979. – No. 16(91). – P. 12-13.
6. Galzy R. Les possibilities de conservation in vitro d^’ une collection de clones de vignes /R. Galzy // Bulletin de I.O.I.V. – 1985. – P.378-390.
7. Blaich R. Investigation on meristem and organ cultures in vitro for selection and conservation of genotypes of the grapevine. / R. Blaich // Bulletin de L: O.I.V. – 1985. – No. 58. – pp. 391-395.
8. Der Einflus von in vitro wachtux nisinhibitoren auf dieangzeit-lagerund von in vitro Kulturen der Rebe/ G. Alleweldt, M.Harst-Langenbucher // Vitis. – 1987. – No. 26,2. – P. 57-64.
9. Technical guidelines for the management of field and in vitro germplasm collections / B.M. Reed, F. Engelmann, M.E. Dulloo, et al. // IPGRI Handbooks for Genebanks No. 7. Int. Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. – 2004.
10. Tehrim S. In vitro establishment, conservation and its implications for grape germplasm biodiversity. / G.M. Sajid, S. Tehrim // Romanian Biotechnol. Lett. – 2011. – No. 16(6). – pp. 6785-6789.
11. In vitro techniques for grapevine germplasm conservation / D. Bosco, I. Sinski, V. Comachio et al. // ActaHortic. – 2015. – No. 1082. – pp. 201-205.
12. Micro propagation and in vitro germplasm conservation of Georgian wild grapevines / D. Maghradze, R. Ocete, J.L. Garcia et al. // Vitis. – 2015. – № 54. – pp. 246–248.
13. Doroshenko N.P. Sozdaniye i khraneniye kollektsii vinograda in vitro [Creation and storage of a collection of grapes in vitro] / N.P. Doroshenko. T.V. Zhukova // Russkiy vinograd [Russian grapes]. – 2016. – Vol.3 – pp.8-14. [in Russian]
14. Polulyakh A.A. Geneticheskiye resursy vinograda instituta «Magarach». Problemy i perspektivy sokhraneniya [Genetic resources of grapes of the institute "Magarach". Problems and prospects of conservation] / A.A. Polulyakh. A. Volynkin. V.V. Likhovskoy // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii [Vavilovsky Journal of Genetics and Breeding]. – 2017. – No. 21(6). – pp. 608-616. DOI 10.18699/VJ17. [in Russian]
15. Doroshenko N. Biotechnological methods of preservation of the grape gene pool in the in vitro collection / Doroshenko. V. Puzirnova // BIO Web Conf. – 2020. – № 25. – 04001. DOI: 10.1051/bioconf/20202504001.
16. Metodicheskiye rekomendatsii po klonalnomu mikrorazmnozheniyu vinograda [Methodological recommendations on clonal micro-reproduction of grapes] / P.Ya. Golodriga et al. // VNIIViPP «Magarach». – Yalta. 1986. – 56 p. [in Russian]
17. Butenko R. G. Biologiya kletok vysshikh rasteniy in vitro. i biotekhnologiya na ikh osnove [Biology of cells of higher plants in vitro, and biotechnology based on them] / R. G. Butenko – M., 1999. [in Russian]
18. Doroshenko N.P. Klonalnoye mikrorazmnozheniye i ozdorovleniye posadochnogo materiala vinograda dlya sozdaniya iz nego sortovykh matochnikov intensivnogo tipa: Rekomendatsii [Clonal micropropagation and improvement of planting material of grapes to create varietal queen cells of intensive type from it: Recommendations] / N.P. Doroshenko. – M.. 1998. – 24 p. [in Russian]
19. Doroshenko N.P. Klonalnoye mikrorazmnozheniye vinograda: Rekomendatsii [Clonal micro-propagation of grapes: Recommendations] / N.P. Doroshenko. – Novocherkassk: Publishing house GNU VNNNViV im.Ya.I. Potapenko, 2012. [in Russian]
20. Patent RU 2764104 C 1.2022. N.P. Doroshenko. V.G. Puzyrnova Sposob formirovaniya kollektsii i dlitelnogo deponirovaniya vinograda in vitro [Patent RU 2764104 C 1.2022. N.P. Doroshenko, V.G. Puzyrnova Method of forming a collection and long-term deposit of grapes in vitro]. [in Russian]