ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ГРИБОВ Р. FUSARIUM И Р. PENICILLIUM К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ (Pb, Cd)
ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ГРИБОВ Р. FUSARIUM И Р. PENICILLIUM К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ (Pb, Cd)
Аннотация
Одним из важнейших путей недопущения деградации почв является ранняя диагностика негативных изменений, поэтому актуален поиск адекватных тест-объектов для агроэкологического мониторинга. В данной работе проводилась оценка толерантности к различным концентрациям соли свинца (0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312 г/л), кадмия (0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0150 г/л) изолятов грибов р. Fusarium, выделенные с ризосферы сои (Glycine max) и р. Penicillium, выделенные с семян сои, выращенной в лесостепной зоне Красноярского края. Парный t-тест, тест Уилкоксона и тест знаков показали, что Fusarium sp. статистически значимо (p<0,05) более чувствителен к присутствию кадмия, чем Penicillium sp, в других вариантах исследования парные тесты не выявили статистически значимых различий. Это связано со сложным нелинейным характером соответствующих кривых «доза-эффект». Толерантность р. Fusarium и р. Penicillium к тяжелым металлам охарактеризована через уравнения зависимости дозы токсиканта и доли погибших конидий (в %). Обнаружено, что для биодиагностики загрязнения ионами свинца (0,25-1,0 мг/л) и кадмия (0,125-0,5 мг/л) возможно использование конидии Penicillium sp., в данных диапазонах зависимость доли погибших конидий адекватно аппроксимируется экспоненциальной функцией.
1. Введение
Ингредиентное загрязнение – это одно из опасных антропогенных воздействий на агроэкосистемы, особенно на важный компонент – почвенную среду. Тяжелые металлы являются приоритетными загрязнителями, негативно влияющие на все биотические компоненты агроэкосистемы.
Основными источниками загрязнения тяжелыми металлами почв сельскохозяйственного назначения являются минеральные удобрения, пестициды, несанкционированные свалки отходов и другие.
Для оценки воздействия влияния антропогенной нагрузки на экосистемы широко используется метод биотестирования , в том числе и в наших работах с помощью стандартных тест-объектов дана оценка экологического состояния земель сельскохозяйственного назначения Красноярского края . Преимущества биологических методов заключается в том, что живые организмы более чувствительны, чем используемые приборы, улавливают более низкие концентрации веществ . В качестве тест-видов для оценки токсичности почв, рекомендованных в стандартных методиках, в настоящее время используют в основном растения и животных (ракообразные, простейшие, кольчатые черви и др.) , .
Грибы являются интересным объектом для биомониторинга. В настоящее время накоплен большой материал о степени реагировании грибов на изменения окружающей среды , . Известно, что грибы обладают сорбционной способностью по отношению к тяжелым металлам и относительно к ним устойчивы , , , , . В небольших количествах многие металлы необходимы для жизнедеятельности грибов (Cu, Mn, Zn, Co, Sn, V, Ni, Cr и др.), однако в больших количествах становятся токсичными. Ряд металлов высокотоксичны и в малых количествах (Cd, Sb, As, Hg, Pb, Ag и др.) , . По литературным данным влияние токсического эффекта тяжелых металлов на микромицеты разнообразно. При выращивании различных грибов на питательных средах в присутствии металлов наблюдалось подавления роста и развитие мицелия, роста колоний, уменьшение спорообразования и изменение морфологии спор, изменение состава продуцируемых экзометаболитов , , , .
Такая способность микромицетов дает возможность поиска новых видов биоиндикаторов для оценки почв загрязненными тяжелыми металлами. Подбор чувствительных тест-объектов, которые адекватно характеризовали бы техногенную нагрузку на природную окружающую среду, актуальна несколько десятилетий. Грибы р. Fusarium и р. Penicillium в качестве объектов исследования выбраны ввиду их широкого распространения в окружающей среде и апробации другими исследователями в отношении Ni, Co, Fe, Mg и Mn , , .
Целью настоящего исследования является изучение чувствительности грибов р. Fusarium и р. Penicillium к различным концентрациям солей свинца и кадмия.
2. Объекты и методы
В качестве тест-культур в работе использованы изоляты грибов р. Fusarium, выделенные с ризосферы сои (Glycine max) и р. Penicillium, выделенные с семян сои, выращенной в лесостепной зоне Красноярского края.
Для определения чувствительности конидий грибов к различным концентрациям металлов смешивали питательную среду в чашках Петри с маточным раствором соли кадмия (сульфат кадмия, безводный, 99+%) для получения следующих концентраций раствора в среде, г/л: 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0150; соли свинца (свинца (II) сульфат, 99.5% (хч)), г/л: 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312. Конидии наносили на поверхность агаризованной среды.
Питательную среду Чапека-Докса, в которую добавляли кадмий, готовили в соответствии с инструкцией производителя: сахароза – 20,0 г/л; нитрат натрия – 2,0 г/л; фосфат калия двузамещенный – 1,0 г/л; сульфат магния – 0,5 г/л; хлорид калия – 0,5 г/л; сульфат железа – 0,01 г/л; агар – 20,0 г/л; рН 7,3±0,2. Чтобы ионы свинца не вступали в ионообменную реакцию с компонентами среды Чапека-Докса и не выпадали в осадок, был подобран следующий состав среды: глюкоза - 20,0 г/л, пептон – 10 г/л, агар-агар микробиологический – 14 г/л.
Чашки инкубировали в течение 20 часов при температуре 26 ºС. Учет жизнеспособности производили прямым методом, по количеству проросших и не проросших конидий грибов. Контролем служили конидии пророщенные на питательной среде без добавления металлов, прорастание конидий составляло 100%.
Для учета результатов эксперимента использовали микроскоп Микмед 6 вар. 7. с цифровой камерой DCM-130M. Анализ данных производили с использованием следующего программного обеспечения: пакет StatSoft STATISTICA 8.0. Статистическую значимость различий между вариантами с тяжёлыми металлами и контролем по прорастанию конидий проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2х2. Подбор уравнений регрессии, описывающих зависимость доли погибших конидий от концентрации тяжёлых металлов, осуществляли с помощью модуля «Пользовательская регрессия» (User-specified regression) с использованием метода наименьших квадратов.
3. Результаты и их обсуждение
В контрольных вариантах прорастание конидий как Fusarium sp., так и Penicillium sp. составило 100 %. Статистически значимое снижение прорастания конидий Fusarium sp. отмечено в присутствии 0,0625 мг/л Pb, 0,5 мг/л Pb, 1 мг/л Pb и 2 мг/л Pb, а также в присутствии 0,015 мг/л Cd, 0,0312 мг/л Cd, 0,125 мг/л Cd, 0,25 мг/л Cd и 0,5 мг/л Cd (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние тяжёлых металлов на прорастание конидий Fusarium sp.
Примечание: «нет» означает отсутствие статистически значимых различий
Таблица 2 - Влияние тяжёлых металлов на прорастание конидий Penicillium sp.
Примечание: «нет» означает отсутствие статистически значимых различий
Рисунок 1 - Прорастание конидий Penicillium sp.
Примечание: А – контроль; Б – ионы кадмия в дозе 0,5 мг/л
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Fusarium sp. от концентрации Pb, имеет вид:
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Fusarium sp. от концентрации Cd, имеет вид:
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Penicillium sp. от концентрации Pb, имеет вид:
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Penicillium sp. от концентрации Cd, имеет вид:
где:
X – концентрация тяжёлого металла (мг/мл),
Y – доля погибших конидий (%),
a1, a2, a3, a4 и a5 – коэффициенты.
Статистическая значимость всех регрессионных моделей p<0,001. Коэффициент детерминации для модели (1) R2=0,99998, для модели (2) R2= 0,98290, для модели (3) R2= 0,99945, для модели (4) R2= 0, 99958. Экспериментальные и теоретические (рассчитанные по соответствующим уравнениям) значения доли погибших конидий при разных концентрациях тяжёлых металлов показаны на рисунках 2–5.
Рисунок 2 - Влияние Pb на жизнеспособность конидий Fusarium sp.
Рисунок 3 - Влияние Cd на жизнеспособность конидий Fusarium sp.
Рисунок 4 - Влияние Pb на жизнеспособность конидий Penicillium sp.
Рисунок 5 - Влияние Cd на жизнеспособность конидий Penicillium sp.
Рисунок 6 - Кривая «доза-эффект» как сумма двух дозовых кривых на примере влияния Pb на жизнеспособность конидий Penicillium sp.
Примечание: f1 – график первой функции в уравнении (3); f2 – график второй функции в уравнении (3) (А); f1+f2 – сумма f1 и f2 (уравнение (3)) (Б)
С практической точки зрения можно рекомендовать использование конидий Penicillium sp. для биотестирования Pb в диапазоне концентраций 0,25-1,0 мг/л и Cd в диапазоне концентраций 0,125-0,5 мг/л. В этом диапазоне зависимость доли погибших конидий адекватно аппроксимируется экспоненциальной функцией.
4. Заключение
В условиях лабораторного опыта, при модельном загрязнении среды ионами тяжелых металлов выявлено токсическое воздействие на грибы р. Fusarium и р. Penicillium к различным концентрациям солей свинца и кадмия. Обнаружено, что к присутствию в среде ионов кадмия Fusarium sp. статистически значимо (p<0,05) более чувствителен, чем Penicillium sp.
В качестве тест-объектов можно рекомендовать использование конидий Penicillium sp. для биотестирования токсичности: ионов свинца в диапазоне концентраций 0,25-1,0 мг/л, ионов кадмия в диапазоне концентраций 0,125-0,5 мг/л.