Анализ биологического разнообразия микробного сообщества слизистой оболочки ротоглотки у пациентов с атопическим дерматитом

Атопический дерматит (АтД) – мультифакториальное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением и возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения. Данное воспалительное состояние кожи является одним из наиболее распространенных заболеваний (от 20% до 40% в структуре кожных заболеваний), встречающееся во всех странах, у лиц обоих полов

Однако современная научная литература подчеркивает, что АтД имеет возрастно-половые особенности течения. Так, в одном из исследований, в котором изучали такие особенности, у 853 пациентов детского и подросткового возраста, установили, что из 853 (100%) пациентов с АтД встречаются 552 мальчика (64,7%), 301 девочка (35,3%). Мальчики преобладают над девочками за 2016 год на 27,7%, за 2017 год на 43,9%, за 2018 год на 19,1%. Половозрастная выявляемость АтД у детей и подростков свидетельствует, что пиковые показатели приходятся на младенчество с преобладанием мальчиков за 2016-2018 год на 24,01%. При этом чаще всего АтД манифестирует у пациентов с отягощенным семейным и аллергологическим анамнезом

К настоящему времени распространенность АтД в Европе составила 15,6%, в США – 17,2%, в Японии – 24%, в России – 30 –35%, что отражает неуклонный рост частоты выявления АтД в течение последних трех десятилетий

Немаловажным фактором, способствующим развитию и прогрессированию АтД, является дисбаланс симбиотической микробиоты дыхательной системы

Цель исследования: проведение анализа биологического разнообразия микробных сообществ ротоглотки у пациентов с АтД.

В исследование было включено 97 пациентов с АтД мужского пола возрастом от 16 до 19 лет, из которых 15 были в ремиссии, 82 – в обострении различной степени тяжести (22 – легкой, 53 – среднетяжелой и 7 – тяжелой). В исследование были отобраны только пациенты, имеющие обострение патологического дерматологического процесса с неясной клинической картиной, похожей на проявление атопического дерматита, и с отсутствием обострений хронических заболеваний сердечно-сосудистой, бронхолегочной и центральной нервной систем, ЛОР-органов, печени, почек.

Критериями исключения в исследовании являлись: любые сопутствующие соматические заболевания или состояния; отклонения в гематологических показателях, которые, по мнению исследователя, затрудняют интерпретацию результатов, или предоставляют опасность для пациента при его участии в исследовании; наличие острого инфекционного процесса; участие в другом клиническом исследовании в течение 30 дней до периода скрининга; алкогольная или наркотическая зависимость в анамнезе.

Для оценки степени тяжести кожного процесса была использована полуколичественная шкала SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis)

Взятие мазка со стенок ротоглотки для культуромного исследования осуществлялось стерильным ватным тампоном. Материал доставлялся в бактериологическую лабораторию в пробирке с жидкой транспортной средой Эймса (ООО ГЕМ, Россия). Посев материала проводился на расширенный перечень питательных сред: универсальную  хромогенную среду (HiMedia, Индия), 5% кровяной агар с бараньей кровью (HiMedia, Индия), шоколадный агар (HiMedia, Индия), селективные среды для выделения лактобактерий (HiMedia, Индия), бифидобактерий (HiMedia, Индия), клостридий (HiMedia, Индия), облигатных анаэробов (HiMedia, Индия), вейлонелл (HiMedia, Индия), неферментирующих грамотрицательных бактерий (HiMedia, Индия), энтеробактерий (HiMedia, Индия), среду Сабуро (HiMedia, Индия). Посевы инкубировались при температуре 37°С в течение 5 суток.

Колонии всех выросших микроорганизмов идентифицировались с использованием метода MALDI-ToF масс-спектрометрии на приборе Microflex LT (Bruker, Германия). При идентификации происходило сравнение полученных спектров микроорганизмов с базой данных стандартной библиотеки Bruker Daltonik GmbH.

Накопление, корректировка, систематизация полученных данных и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016. Статистические расчёты проводились с использованием программного обеспечения StatTech (версия 4.0.0, разработчик ООО «Статтех», Россия). Сравнение категориальных переменных (сравнение процентных долей) выполнялось с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. Статистически значимыми принимали значения р≤0,05.

Для оценки биологического разнообразия микробиоты использовался показатель коэффициент постоянства С. В случае выделения микроорганизма в более чем 50% случаев, у обследованных в отдельном локусе данный представитель микробиоты расценивался как постоянный. Распространенность микроорганизмов в пределах 25-50% считалась соответствующей добавочной микробиоты, менее 25% – транзиторной микробиоте. Данный коэффициент рассчитывался по формуле:

где р – число наблюдений с выделением отдельного вида микроорганизма, Р – общее число наблюдений.

При исследовании биологического разнообразия микробиоты ротоглотки у пациентов, включенных в исследование, было выделено и идентифицировано 58 видов микроорганизмов.

В зависимости от степени тяжести течения АтД были получены статистически значимые различия по частоте встречаемости следующих видов (табл. 1).

В результате сравнения исследуемых групп было выявлено, что Streptococcus vestibularis достоверно реже выделялся у пациентов с легкой степенью тяжести АтД. Proteus mirabilis, Acinetobacter pitti и Neisseria lactamica реже выделялись у пациентов с легкой и со средней степенью тяжести. Несмотря на полученные достоверные различия по частоте выделения представленных в таблице 1 микроорганизмов, следует учитывать, что представители трех видов были выделены в единичных случаях у пациентов из группы с тяжелым обострением.

Для оценки вклада микроорганизмов разных видов в биологическое разнообразие для каждого представителя микробиоты слизистой оболочки ротоглотки был рассчитан коэффициент постоянства вида в трех группах пациентов по степени тяжести и у пациентов с АтД в состоянии ремиссии.

Представители добавочной и постоянной микробиоты слизистой оболочки ротоглотки у пациентов с АтД представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Видовое разнообразие добавочной и постоянной микробиоты слизистой оболочки ротоглотки у пациентов с АтД в зависимости от риска развития обострения и степени его тяжести

DOI:10.23670/IRJ.2024.142.114.2

Единственным видом, который можно отнести к постоянным в микробиоте слизистой оболочки ротоглотки у пациентов с АтД, является Neiserria subflava, которая была выделена у 50,9-73,3% обследованных. Для остальных видов были выявлены три типа закономерностей: первая – увеличение значения коэффициента постоянства с переходом от случайной к добавочной и постоянной микробиоте; вторая – уменьшение значения коэффициента постоянства при переходе к случайным видам; третья – отсутствие достоверных изменений в значении коэффициента постоянства в зависимости от степени тяжести АтД.

К первой группе были отнесены следующие виды: Streptococcus vestibularis (от 13,3% в состоянии ремиссии до 47,2% у пациентов средней степени тяжести АтД и 42,9% у пациентов с тяжелым течением); Streptococcus mitis и Actinomyces oris (от 13,3% в состоянии ремиссии до 28,6% у пациентов с тяжелым течением); Rothia mucilaginosa (от 20,0% в состоянии ремиссии до 43,4% у пациентов средней степени тяжести АтД и 42,9% у пациентов с тяжелым течением). Изменение коэффициента постоянства для этих видов, характерное для перехода от случайной к добавочной микробиоте, было выявлено у пациентов с возрастанием степени тяжести АтД. Данные виды следует рассматривать как потенциально клинически значимые и возможные маркеры прогнозирования течения АтД у юношей подростков.

Ко второй группе были отнесены следующие виды: Streptococcus salivarius (от 46,7% у пациентов в ремиссии до 28,6% у пациентов с тяжелым течением АтД); Streptococcus parasanguinis (от 33,3% у пациентов в ремиссии до 14,3% у пациентов с тяжелым течением АтД); Streptococcus oralis (от 40,0% у пациентов в ремиссии до 14,3% у пациентов с тяжелым течением АтД); Staphylococcus aureus (от 26,7% у пациентов в ремиссии до 14,3% у пациентов с тяжелым течением АтД); Rothia dentocariosа (от 33,3% у пациентов в ремиссии до 0,0% у пациентов с тяжелым течением АтД). При этом следует отметить, что Streptococcus salivarius у пациентов с легкой и средней степенью тяжести АтД входит в состав постоянной микробиоты полости ротоглотки, Streptococcus parasanguinis – в состав добавочной микробиоты у всех пациентов за исключением пациентов с тяжелым течением АтД, Streptococcus oralis и Rothia dentocariosа – в состав добавочной микробиоты у пациентов в ремиссии и с легким течением АтД. Интересными получились данные о распространенности золотистого стафилококка. В качестве добавочной микробиоты ротоглотки он был выделен только у пациентов в ремиссии и пациентов с легким течением АтД, у пациентов средней и тяжелой степени тяжести данный микроорганизм являлся представителем случайной микробиоты.

Для микроорганизмов первой и второй групп были получены достоверные различия по частоте встречаемости в зависимости от стадии АтД (таблица 2).

Выделение Streptococcus vestibularis описано достоверно чаще в группе пациентов, находящихся в обострении, тогда как Streptococcus oralis и Rothia dentocariosа чаще выделяются у пациентов в ремиссии.

Третья группа микроорганизмов включила Neiserria flavescens, которая была отнесена к случайной и добавочной микробиоте в зависимости от степени тяжести АтД и риска развития обострения у пациентов (в состоянии ремиссии была выделена у 26,7% пациентов, в состоянии легкой и средней степени тяжести у 22,7% и 20,8% соответственно, у пациентов с тяжелым течением – у 28,6%).

В микробиоте слизистой оболочки ротоглотки было выделено значительное число микроорганизмов, которые оказались представителями случайной микробиоты (представители порядка Enterobacterales – Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp.; представители нормальной микробиоты – Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Moraxella spp., Actinomyces spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., Gemella spp., Granulicatella spp., Neiserria spp., Kocuria rhizophila,  Haemophilus parainfluenzaе; а также микробы других групп – Candida albicans, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzaе, Neisseria meningitidis, Brevundimonas diminuta, Fusobacterium canifelinum. Acinetobacter pitti, Acinetobacter junii, Acidovorax temperans). Данные микроорганизмы оказались самыми многочисленными как по числу родов, так и видов, что с одной стороны показывает возможности использования культуромного метода в оценке биологического разнообразия микробиоты слизистой оболочки ротоглотки, с другой – открывает возможности для поиска новых потенциальных микробных маркеров, определяющих тяжесть течения АтД.

Биологическое разнообразие случайной, добавочной и постоянной микробиоты ротоглотки у пациентов с ремиссией и в различные стадии обострения АтД, демонстрирует определенные закономерности, важные с точки зрения оценки изменения микробиоты пациентов в зависимости от тяжести заболевания. Выявление переходов отдельных представителей микробиоты из случайной в добавочную и постоянную и обратно в зависимости от стадии обострения позволяет более подробно проанализировать потенциальное влияние отдельных видов микроорганизмов на патологические и физиологические процессы при АтД. Данный факт свидетельствует о необходимости более глубокого изучения симбиотических взаимоотношений и функциональной активности микроорганизмов.