РАЗРАБОТКА ОКИСЛИТЕЛЯ И УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ ДЛЯ УСТОЙЧИВОГО И ВОСПРОИЗВОДИМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОФЕИНА МЕТОДОМ МУРЕКСИДНОЙ ПРОБЫ

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.118.4.103

РАЗРАБОТКА ОКИСЛИТЕЛЯ И УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ ДЛЯ УСТОЙЧИВОГО И ВОСПРОИЗВОДИМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОФЕИНА МЕТОДОМ МУРЕКСИДНОЙ ПРОБЫ

Научная статья

Бидоленко В.В.¹, Попов А.С.², Иванова И.С.^{3, *}, Чухно А.С.⁴

² ORCID: 0000-0002-9692-0009;

³ ORCID: 0000-0001-7880-9756;

^1,2,3,4Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия

^* Корреспондирующий автор (ivanovaira1[at]yandex.ru)

Аннотация

Контроль содержания N-метил производных мочевой кислоты в качестве активных веществ или сопутствующих субстанций необходим для более, чем 150 препаратов, включенных в Государственный реестр лекарственных средств. Мурексидная проба является достоверным способом идентификации кофеина и других производных пурина, она используется как основа в ряде физико-химических инструментальных методов. В работе разработаны оптимальный состав окислителя и условия проведения мурексидной пробы для простой, двухстадийной методики качественного определения кофеина и других производных пурина как в чистом виде, так и в лекарственных препаратах. Это позволило добиться воспроизводимости и достоверности результатов реакции. В ходе экспериментальных исследований было показано, что несоответствие окраски продуктов реакции заявленным методикам связано с образованием тетраметилаллоксантина. Проанализированы преимущества разработанной методики по сравнению с литературными данными.

Ключевые слова: мурексидная проба, пурпурат аммония, тетраметилаллоксантин, диметилдиалуровая кислота, кофеин, пурины.

DEVELOPMENT OF AN OXIDIZER AND REACTION CONDITIONS FOR A STABLE AND REPRODUCIBLE DETERMINATION OF CAFFEINE VIA THE MUREXIDE TEST

Research article

Bidolenko V.V.¹, Popov A.S.², Ivanova I.S.^3*, Chukhno A.S.⁴

² ORCID: 0000-0002-9692-0009;

³ ORCID: 0000-0001-7880-9756;

^1,2,3,4Mechnikov North-West State Medical University,Saint Petersburg, Russia

^* Corresponding author (ivanovaira1[at]yandex.ru)

Abstract

Control of the content of N-methyl derivatives of uric acid as active substances or concomitant substances is necessary for more than 150 drugs included in the State Register of Medicines. The murexide test is a reliable way to identify caffeine and other purine derivatives, it is used as a basis in a number of physico-chemical instrumental methods. The study develops the optimal composition of the oxidizer and the conditions for conducting a murexide test for a simple, two-stage method for the qualitative determination of caffeine and other purine derivatives both in pure form and in medicinal preparations. This makes it possible to achieve reproducibility and reliability of the reaction results. The experimental studies show that the discrepancy in the color of the reaction products with the claimed methods is associated with the formation of tetramethylalloxanthine. The authors analyze the advantages of the developed methodology in comparison with the literature data.

Keywords: murexide test, ammonium purpurate, tetramethylalloxanthine, dimethyldialuric acid, caffeine, purines.

Введение

Алкалоиды пуринового ряда получили широкое распространение в медицинской практике: на сегодняшний день реестр лекарственных средств насчитывает более 150 препаратов [1], содержащих в качестве активного вещества N-метил производные мочевой кислоты. Препараты теофиллина относится к классу бронхолитических препаратов, использующихся при терапии респираторных заболеваний, при этом оказывая лечебный эффект при концентрации в сыворотке крови 10-20 мкг/мл, а при содержании свыше 20 мкг/мл оказывает токсическое действие [2, C. 368]. Теобромин, больше всего содержащийся в какао-бобах, подобно теофиллину, применяется при бронхолёгочных заболеваниях. В последнее время он нашёл применение как вспомогательный компонент зубных паст, выступающий в качестве стимулятора образования гидроксиапатитов, обеспечивая реминерализацию эмали и предупреждая развитие кариозных повреждений. Кофеин, главным образом, содержится в чайных листьях и зёрнах кофе. Обнаружение кофеина в пищевых продуктах может служить достоверным показателем их качества и безопасности. Кофеин в малых дозах обладает выраженными психостимулирующими и аналептическими свойствами, что позволяет его использовать не только для лечения заболеваний, сопровождающихся угнетений функций ЦНС и сердечно-сосудистой системы [3], [4], [5, C. 344]. Вместе с тем, препарат широко используют в качестве основного тонизирующего компонента газированных и энергетических напитков [6]. Необходимость контроля содержания кофеина как в растительном сырье, так и в продуктах питания обусловлена тем, что границы диапазонов лечебной и токсической концентрации препарата кофеина (и кофеин-бензоата натрия) близки. В Российской Федерации правовое регулирование этого вопроса основано на законодательных и нормативных документах [7].

Мурексидная проба является традиционным и достоверным способом идентификации кофеина параллельно с реакцией осаждения с общими алкалоидными реактивами. В соответствии с литературными данными, мурексидная проба является групповой реакцией на алкалоиды пуринового ряда [8]. Метод мурексидной пробы состоит в экстракции кофеина хлороформом из анализируемого образца, окислительно-гидролитическим разложении ксантинов до пиримидиновых производных с их последующей конденсацией до пурпуровой кислоты (см. рисунок 1).

Тетраметилпурпуровая кислота дает специфическое пурпурное окрашивание в присутствии аммиака или солей аммония. Возникновение характерной пурпурной окраски для тетраметилпурпуровой кислоты объясняется кето-енольной таутомерией, которая обуславливается единой p-π сопряженной системой гетероцикла [9, C. 508]. Сравнительный анализ литературных источников [4], [8], [10] приводит к определенному противоречию в описании цвета итогового продукта: оранжевый или краснокирпичный осадок выдается за характерный цвет мурексида.

Современные физико-химические методы определения кофеина также основаны на этой реакции, так спектрофотометрическое определение на длине волны 272 нм включено в Государственную фармакопею РФ [11].

Целью настоящего исследованияявляется выяснение причин указанного противоречия и совершенствование методики проведения мурексидной пробы для различных метилксантинов посредством подбора оптимальных условий реакции, реактивов, состава и концентраций окислительной смеси.

Материалы и методы

В настоящей работе установлено, что противоречие в результатах заявленных методик [4], [8], [10], вероятнее всего, связано с неправильным подбором окислительного реагента для метильных производных ксантинов, в частности кофеина. Поэтому для постановки воспроизводимого экспериментального результата была выбрана относительно мягкая окислительная смесь – 30% пероксид водорода (ГОСТ 177-88, медицинская марка «А», ООО «МДМ Хим») и соляная кислота с концентрацией 25% (ГОСТ 3118-77, чда himreactiv.ru). При выборе окислителя пришлось отказаться от жестких реагентов – концентрированной азотной кислоты или хромовой смеси, использующихся в классической мурексидной пробе, для мочевой кислоты [4], так как наличие метильных радикалов в молекуле кофеина приводит к более глубокому окислению и изменению состава смеси продуктов реакции.

В выпаривательную чашу помещают 0,01 г кофеина, прибавляют 0,5 мл 30% пероксида водорода, 4-5 капель 25% концентрированной соляной кислоты и выпаривают досуха на спиртовке. К полученному сухому остатку по каплям добавляют избыток раствора 25% аммиака (ГОСТ 3760-79, чда, ОАО «Сигма Тек»). Установлено, что нагревание и выпаривание следует проводить медленно, в несколько этапов, не допуская пригорания реакционной смеси. Развивается насыщенное фиолетово-пурпурное окрашивание (см. рисунок 2, 3 и 4).

Важным представляется вопрос экстракции кофеина для дальнейшего определения. В исследовании кофеин-содержащие химикаты и смеси предварительно обрабатывались 25% водным аммиаком в течение 30 минут, это необходимо для освобождения кофеина из коньюгатов и переведения его в раствор. Для проведения собственно экстракция из раствора испытаны два органических растворителя: хлороформ (ТУ 2631-066-44493179-01, чда, АО «Экос-1») и диэтиловый эфир (ТУ 2600-001-43852015-10, чда, ОАО «Медхимпром»). Найдено, что использование диэтилового эфира приводит к неоднозначным результатам и некоторой потери кофеина в экстракте. Это связано с тем, что экстракция кофеина диэтиловым эфиром не может количественно пройти после применения водного аммиака, необходимо закисление раствора. В случае чистого хлороформа такой проблемы не обнаружено, экстракция происходит количественно и быстро.

Предлагаемая усовершенствованная методика проверена на фармацевтическом препарате кофеина, который содержит кофеин-бензоат натрия. В этом случае предварительно препарат растворялся в хлороформе, это приводит к экстракции самого кофеина и отделению бензоата. После фильтрования и отделения бензоата натрия, кофеин выделялся при выпаривании хлороформа и затем перекристаллизовывался в этаноле. Разработанная методика мурексидной пробы апробирована на нескольких лекарственных средствах, имеющих государственную регистрацию: Кофеин-бензоат натрия р-р для подкожного введения, 200мг/мл ампулы по 1мл №10, ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов» Республика Беларусь; Кофеин-бензоат натрия таблетированный, 100мг №10 «Татхимфармпрепараты» и Кофеин-бензоат натрия таблетированный 100мг N6 «Татхимфармпрепараты». Во всех трех случаях характерное пурпурное окрашивание хорошо воспроизводилось.

Полученные результаты

Нагревание в присутствии пероксида водорода приводит к расщеплению имидазольного ядра кофеина до мочевины и последующему окислению пиримидинового кольца до диметилаллоксана и диметилдиалуровой кислоты. Соляная кислота выступает в роли кислотного катализатора на стадии конденсации: протонирование кислорода диметилаллоксана приводит к делокализации положительного заряда, стабилизированного двумя резонансными структурами, это облегает нуклеофильную атаку гидроксильной группы диметилдиалуровой кислоты и приводит к образованию тетраметилаллоксантина (амалиновой кислоте), раствор которой имеет характерную насыщенную желто-лимонную окраску (см. рисунок 2).

Способность молекулы к делокализации отрицательного заряда объясняет возможность солеобразование с одновалентными катионами, в результате чего при действии избытка аммиака происходит образование пурпурата аммония (см. рисунок 5). При этом наблюдается переход от пурпурной окраски к ярко-красной, которая со временем блекнет, а в растворе происходит выпадение осадка краснокирпичного цвета с зелёным блеском – нерастворимые в воде кристаллы мурексида (см. рисунок 6).

Выводы

Установлено, что использование для мурексидной пробы в качестве окислителя смеси 30% перекиси водорода и 25% соляной кислоты для определения производных пурина позволило получить воспроизводимое и устойчивое окрашивание.

Предлагаемая методика качественного определения кофеина обладает высокой чувствительностью, хорошей селективностью и апробирована при анализе нескольких готовых лекарственных форм.

Экспериментально обосновано, что отличие цвета продуктов реакции (кирпично-красного или оранжевого) от характерного пурпурного окрашивания связано с более глубоким окислением неконденсированных диметилдиалуровой кислоты и диметилаллоксана.

Рис. 1 – Образование тетраметилпурпуровой кислоты

Рис. 2 – Тетраметилаллоксантин

Рис. 3 – Начало образования тетраметилпурпуровой кислоты и появление характерного пурпурного окрашивания после добавления водного аммиака

Рис. 4 – Тетраметилпурпуровая кислота через несколько минут после появления окраски

Рис. 6 – Выпадение кристаллов тетраметилпурпурата аммония

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. – URL:http:// grls.rosminzdrav.ru (дата обращения: 23.03.2022).
2. Фармакология с рецептурой: учебник для медицинских и фармацевтических учреждений среднего профессионально образования/под ред. В.М. Виноградова – 7-е изд. и доп. – Санкт-Петербург: СпецЛит, 2019. – 647 с.
3. Пожарский А.Ф. Гетероциклические соединения в биологии и медицине. / А. Ф. Пожарский // Соросовский образовательный журнал. – 1996 – № 6 – c. 25-32.
4. Органическая химии: учеб. для вузов: в 2 кн. Кн. 2: Спец.курс. / Под ред. Н.А. Тюкавкиной. – М.: Дрофа, 2008. – 592 с.
5. Биохимическая фармакология: Учебное пособие/под ред. П.В. Сергеева, Н.Л. Шимановского. – М.:ООО «Медицинское информационное агентство», 2010. – 624 с.
6. СанПиН 2.4.5.2409–08 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации питания обучающихся в общеобразовательных учреждениях, учреждениях начального и среднего профессионального образования».
7. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».
8. Джоуль Дж. Химия гетероциклических соединений. 2-е перераб. изд. / Дж. Джоуль, К. Милле // Пер. с англ. Ф.В. Зайцевой, А.В. Карчава. – М.: Мир, 2004. – 728 с.
9. Фармацевтическая химия: учебная литература для студентов фармацевтических вузов и факультетов / под ред. А.П. Арзамасцева. – М.: ГАОТАР-МЕД, 2004. –662 с.
10. Джилкрист Т. Химия гетероциклических соединений – М.: Мир, 1996. – 464 с.
11. Государственная фармакопея Российской Федерации. — Изд. 14- е. Том 2. — М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2018. –601 с.

Список литературы на английском языке / ReferencesinEnglish

1. Gosudarstvennyj reestr lekarstvennyh sredstv [State Register of Medicines] [Electronicresource]. – URL:http:// grls.rosminzdrav.ru (accessed:23.03.2022). [in Russian].
2. Farmakologiya s recepturoj: uchebnik dlya medicinskih i farmacevticheskih uchrezhdenij srednego professional'no obrazovaniya [Pharmacology with a recipe: textbook for medical and pharmaceutical institutions of secondary vocational education] / V.M. Vinogradova – 7-th edition. – Sankt-Peterburg: SpecLit, 2019. – 647 p. [in Russian]
3. Pozharskij A.F. Geterociklicheskie soedineniya v biologii i medicine. [Heterocyclic compounds in biology and medicine]. / A. F. Pozharskij // Sorosovskij obrazovatel'nyj zhurnal [Soros Educational Journal]. – 1996 -№ 6 – P. 25-32. [in Russian]
4. Organicheskaya himii: ucheb. dlya vuzov : Spec.kurs. [Organic chemistry: textbook for universities: in 2 books. Book 2.] / N.A. Tyukavkina. –M.: Drofa, 2008. – 592p. [in Russian]
5. Biohimicheskaya farmakologiya: Uchebnoe posobie [Biochemical Pharmacology: A textbook] / P.V. Sergeeva, N.L. SHimanovskogo. – M.: OOO «Medicinskoe informacionnoe agentstvo», 2010. – 624 p. [in Russian]
6. SanPiN 2.4.5.2409–08 «Sanitarno-epidemiologicheskie trebovaniya k organizacii pitaniya obuchayushchihsya v obshcheobrazovatel'nyh uchrezhdeniyah, uchrezhdeniyah nachal'nogo i srednego professional'nogo obrazovaniya»[SanPiN 2.4.5.2409-08 "Sanitary and epidemiological requirements for catering of students in general education institutions, institutions of primary and secondary vocational education"][in Russian].
7. Tekhnicheskij reglament Tamozhennogo soyuza TR TS 021/2011 «O bezopasnosti pishchevoj produkcii».[Technical Regulations of the Customs Union TR CU 021/2011 "On food safety"] [in Russian]
8. Dzhoul' Dzh. Himiya geterociklicheskih soedinenij [Chemistry of heterocyclic compounds. 2nd edition // Translated from the English by F.V. Zaitseva, A.V. Karchava. – M.: Mir, 2004. – 728 p. [in Russian]
9. Farmacevticheskaya himiya: uchebnaya literatura dlya studentov farmacevticheskih vuzov i fakul'tetov [Pharmaceutical chemistry: educational literature for students of pharmaceutical universities and faculties] / A.P. Arzamascev. –M.: GAOTAR-MED, 2004. –662 p. [in Russian]
10. Dzhilkrist T. Himiya geterociklicheskih soedinenij [Chemistry of heterocyclic compounds] – M.: Mir, 1996. – 464 p. [in Russian]
11. Gosudarstvennaya farmakopeya Rossijskoj Federacii. [State Pharmacopoeia of the Russian Federation]. —14-th edition. Vol 2. — M.: Nauchnyj centr ekspertizy sredstv medicinskogo primeneniya [Scientific Center for the Examination of medical products], 2018. –601 p. [in Russian]