РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO ЧЁРНОЙ МАЛИНЫ

Соловых Н.В.

Кандидат биологических наук, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, Россия, г. Мичуринск

РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO ЧЁРНОЙ МАЛИНЫ

 Аннотация

С целью повышения эффективности размножения чёрной малины in vitro оптимизирован минеральный, гормональный и углеводный состав питательной среды.

Ключевые слова: клональное размножение, in vitro, чёрная малина

Solovykh N.V.

PhD in Biology, Russian Research Institute of Genetics and Fruit Plant Breeding named after I.V. Michurin, Russia, Michurinsk

IN VITRO PROPAGATION OF BLACK RASPBERRY

Abstract

The mineral, hormonal and carbohydrate composition of nutrient medum was optimized for increasing of efficiency of propagation of black raspberry in vitro.

Keywords: clonal propagation, in vitro, black raspberry

Клональное размножение растений in vitro позволяет производить оздоровленный  посадочный материал высших категорий качества. В селекционной практике этим методом обеспечивают быстрое тиражирование ценных генотипов, полученных в процессе гибридизации, генетической трансформации, тканевой и клеточной селекции. Несмотря на то, что методы клонирования в искусственной культуре хорошо разработаны для многих видов рода Rubus, в работе с малиной чёрной (Rubus occidentalis L.) имеет место ряд трудностей. Это сравнительно низкие коэффициенты размножения и склонность и каллусообразованию, затрудняющая ризогенез in vitro.

В.С. Андерсон  [1] предложил для размножения этой культуры  относительно бедную азотом, но богатую фосфором и железом среду. Позднее было установлено [2, 3], что клонирование чёрной малины можно проводить и  на традиционно применяемой для растений рода Rubus среде MS [4] с высоким содержанием азота и меньшим содержанием фосфора и железа, чем среда Андерсона [1]. Для снятия апикального доминирования использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации 1,0 мг/л.

В лаборатории биотехнологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина изучали влияние  различных модификаций минерального и гормонального состава питательных сред, а также состава и концентрации сахаров на размножение и укоренение in vitro чёрной малины сорта Кумберленд.

Микропобеги высаживали на среды по прописям Андерсона [1], MS [4] и среду QL [5], подвергнутую модификации [6]. Нами также проводилась модификация среды MS по содержанию аммонийного и нитратного азота, сахарам и железу. В качестве сахаров использовали сахарозу, глюкозу, лактозу и галактозу. Для снятия апикального доминирования на этапе размножения применяли цитокинины из группы аденина: 6-фурфуриламинопурин (кинетин), 6-БАП, 2-изопентиладенин (2-iP) и  зеатин, а также тидиазурон (ТДЗ), относящийся к группе дифенилмочевины. Концентрации цитокининов из группы аденина составили 0,25 – 2,0 мг/л, концентрации тидиазурона  0,025 − 0,2 мг/л.  На этапе укоренения применяли среду MS с уменьшенным вдвое содержанием макросолей, содержащую один из ауксинов: β-индолилуксусную кислоту (ИУК), β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), α-нафтилуксусную кислоту (НУК) или 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д). Ауксины добавляли непосредственно в среду укоренения, их концентрации составили 0,2 − 2,0 мг/л.

Сравнение эффективности использования для размножения чёрной малины применяемых ранее питательных сред, в которые вносили 1,0 мг/л 6-БАП,  показало, что наибольший коэффициент размножения (3,7±0,8) и наибольшую среднюю длину побега (24,8±4,5 мм) в течение первых 30 суток культивирования малина чёрная демонстрировала на  среде Андерсона. При этом она образовывала побеги интенсивно-зелёного цвета. На традиционно используемой при работе с растениями рода Rubus среде MS коэффициент размножения после первых тридцати суток культивирования составил всего 2,5±0,7,  средняя длина побега была почти в полтора раза меньше, чем на среде Андерсона. Использование среды QL не показало статистически значимых различий по сравнению со средой MS по показателям роста и размножения побегов.

Недостатком среды Андерсона является то, что она быстро  истощается, и на ней прекращается размножение побегов. Наиболее успешным оказалось применение модифицированной среды MS, в которой вдвое было уменьшено содержание как нитрата калия, так и нитрата аммония, вдвое увеличена концентрация хелата железа, дигидрофосфат натрия отсутствовал. На такой 4модифицированной среде с пониженной концентрацией 6-БАП (0,5 мг/л) удалось продолжать беспересадочное культивирование чёрной малины в течение трёх месяцев, при этом коэффициент размножения составил 4,6±0,8, а средняя длина побега 32±5,4 мм.

Изучение влияния разных сахаров на клональное размножение чёрной малины показало, что лактоза и галактоза уступают по эффективности традиционно применяемой для этой цели сахарозе. Использование в качестве углевода глюкозы в ряде опытов не дало математически существенных различий с результатами использования сахарозы. Но на среде MS с модифицированным минеральным составом, содержащей 0,5 мг/л 6-БАП или 0,025 − 0,05 мг/л ТДЗ, использование глюкозы вместо сахарозы позволило получить увеличение коэффициента размножения на 17,3 – 22,5%. Оптимальные концентрации сахарозы и глюкозы для малины чёрной на этапе размножения составили 25 – 30 г/л.

Установлено, что из цитокининов группы аденина наиболее эффективным для размножения чёрной малины является 6-БАП. Кинетин, зеатин и изопентиладенин даже в оптимальных концентрациях не позволяют получить коэффициент размножения выше 2,2. Оптимальная концентрация 6-БАП была равна 0,5 мг/л. При более высоких концентрациях на первых этапах удавалось добиться более высоких коэффициентов размножения (до 2,6 – 2,8 в разных опытах), но уже через две недели с момента высадки начиналась некротизация нижних листьев и требовалась пересадка на свежую среду. Средняя длина побегов не превышала 2,2±0,5 мм, при этом многие побеги оказывались непригодными для укоренения в силу маленького размера.

Более эффективным на этапе клонального размножения оказалось использование ТДЗ. Наибольший коэффициент размножения на модифицированной среде MS (5,6±0,8) наблюдался при концентрации 0,05 мг/л, при которой удавалось проводить беспересадочное культивирование чёрной малины в течение двух месяцев и получать побеги со средней длиной (29,6±0,7 мм). Повышение содержания ТДЗ приводило к отмиранию нижних листьев. Концентрация 0,025 мг/л давала низкий коэффициент размножения (1,6±0,4).

На среде с концентрациями макросолей и сахарозы равными ½ MS, корнеобразование происходит и в отсутствие ауксина. Но первые корни появляются через 40 −45 дней, и их число растёт очень медленно, не позволяя  быстро получить хорошо развитую корневую систему у большинства растений, что мешает своевременной высадке их на адаптацию. Поэтому на этапе укоренения in vitro используют среды, содержащие ауксины. Наиболее эффективным оказалось применение ИМК, что согласуется с литературными данными [2, 3]. Однако в наших опытах оптимальными  являлись концентрации ИМК равные 0,2 – 0,5 мг/л, т.к. увеличение содержания ауксина приводило к образованию каллуса. На среде MS с половинным содержанием макросолей и сахарозы (15 г/л), содержащей 0,2 и 0,5 мг/л ИМК, каллусообразование всё же имело место. Однако в течение полутора месяцев со дня высадки достигнуто укоренение соответственно 69,0±5,6% и 74,1±4,3% эксплантов при среднем числе корней на одно растение соответственно  4,3±0,9 и 4,5±0,6 [7].

Проведение адаптации пробирочных растений чёрной малины к условиям in vivo возможно в плёночной теплице с воздушно-капельным орошением.  При высадке в последней декаде мая растений с хорошо развитой корневой системой (средняя длина корневой системы 78,5±4,9 мм) получена  адаптация 74,0±6,7%. Это ниже, чем при высаживании в контейнеры со стерильным субстратом [2, 3], но потери некоторой части укоренённых растений компенсируются ускорением процесса и значительной экономией затрат труда.

Таким образом, на этапе размножения in vitro применение модифицированной среды MS с уменьшенным вдвое содержанием аммонийного и нитратного азота и удвоенным содержанием железа, замена сахарозы на глюкозу и использование в качестве вещества с цитокининовой активностью ТДЗ в концентрации 0,05 мг/л позволяет существенно (на 51,4%) увеличить выход пригодных для укоренения микропобегов по сравнению со стандартной методикой [2, 3]. На этапе ризогенеза наиболее эффективно применение ИМК в концентрации 0,2 – 0,5 мг/л. Ускорить процесс адаптации пробирочных растений чёрной малины in vivo можно путём высадки в мае укоренённых in vitro растений в плёночную теплицу с воздушно-капельным орошением.