ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОЦЕНКИ СЫВОРОТОЧНОЕ ВЫСШИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ У БОЛЬНЫХ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ

Кадыров А.Х.¹, Саидов С.С.², Абдурахимова  М.К.³, Самандаров Н.Ю.⁴

¹Профессор, доктор химических наук, зав. отделением клинической биохимии Институт, гастроэнтерологии  МЗ Республики Таджикистан; ²Доценткандидат химических наук, декан химфака ТНУ; ³Соискатель ТНУ; ⁴Аспирант ТНУ

ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОЦЕНКИ СЫВОРОТОЧНОЕ ВЫСШИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ У БОЛЬНЫХ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ

Аннотация

 В данной работе показана возможность и целенаправленность применения метода газожидкостной хроматографии с целью исследования содержания высших жирных кислот в сыворотке кровы здоровых лиц и у больных с стеатозом печени и стеатогепатитом. Показано что у больных с стеатозом печени и стеатогепатитом по сравнению с контролем значительно возросло содержание насыщенных кислот, особенно пальмитиновой и стеариновой кислот. В тоже время наблюдается резкое снижения уровня линолевой кислоты, особенно в стадии стеатогепатите, который является одним из важнейших полиненасыщенных кислот.

Ключевые слова: высших жирных кислот, определение газовая хроматография, стеатоз, стеатогепатит.

Kadyrov A.H.¹ Said S.S.², Abdurahimova M.K.³, Samandarov N.YU.⁴

¹Professor, doctor of chemical sciences and head. Department of Clinical Biochemistry, Institute of Gastroenterology Ministry of Health of the Republic of Tajikistan; ²Dotsentkandidat of Chemistry, Dean of the Chemistry Department TNU; ³Competitor TNU; ⁴PhD student TNU

HIGHER GAS CHROMATOGRAPHIC EVALUATION OF SERUM FATTY ACID IN PATIENTS WITH FATTY LIVER DISEASE

Abstract

In this work we show the possibility and purpose of the method of gas-liquid chromatography to study the content of higher fatty acids in the blood serum of healthy individuals and in patients with hepatic steatosis and steatohepatitis. It is shown that patients with liver steatosis and NASH compared to control significantly increased content of saturated acids, particularly palmitic and stearic acids. At the same time, a sharp reduction of linoleic acid, especially in the stage of steatohepatitis, which is one of the most important polyunsaturated fatty acids.

Keywords: higher fatty acids determination of gas chromatography, steatosis, steatohepatitis. 

Качественного и количественного анализа состава высших жирных кислот в биологических жидкостях и тканях стало возможным благодаря применению газовую хроматографию. Используя этот  метод  можно определять жирно-кислотной состав сыворотке и крови [1-2], позволяет получить более важной информацию о состоянии жирового обмена в норме и при различных патологических состояниях.

До настоящего времени в литературе нет достаточных сведений о содержания высших жирных кислот в сыворотке крови  больных жировой болезни печени, а так же нет информации взаимосвязи высших жирных кислот с холановых  кислот,  количество  отложившихся триглицеридов,  и из каких высших жирных кислот образуется эти  триглицериды.

В тонких кишках после переваривания пищи, богатой жирами, можно обнаружить жирные кислоты, их соли и смесь моно-, ди-и триглицеридов в виде тонкой эмульсии. Глицерин, образующийся при  переваривании  жиров, как вещество, хорошо растворимое в воде, может всасываться стенкой кишок. Всасывание жирных кислот, нерастворимых в воде происходит с участием холановых кислот. Холановые  кислоты  соединяются с высокомолекулярными жирными кислотами, образуя растворимые в воде комплексы, холеиновые кислоты. Холеиновые кислоты поступают в стенку кишок и в эпителиальных клетках кишечных ворсинок вновь распадаются на  холановые и жирные кислоты. В клетках  кишечного эпителия из глицерина и жирных кислот синтезируются жиры. Некоторое количество жира в виде капелек меньшем диаметром  может всосаться стенкой кишок без предварительного переваривания. Эмульсии моно глицеридов значительно более устойчивы, чем эмульсии жирных кислот, поэтому надо отметить, что триглицериды не подвергаются польному перевариванию, а образуют смесь из моно-и диглицеридов и жирных кислот.

 Известно, что в условиях гиперинсуленемии в жировой ткани нарастает  липолиз  с высвобождением большого количества свободных жирных кислот в печени, снижение скорости,  окисления которых приводит к  отложению триглицеридов в гепатоцитах, что способствует развитию её жировой болезни. Известна диагностике и лечение неалкогольной жировой болезни печени [3], включающая выполнение биохимического анализа крови и выявляющая поражения печени. Уровень АсТ,  АлАТ, ГГТП и других  ферментов скорее свидетельствует о степени поражения печени, и имеют мало достоверных фактов,  а не степень её жировой инфильтрации.

 Известен  другое сообщение о диагностики неалкогольной  жировой болезни печени [4], который основывается на изучении биопсии печени. Данный способ не позволяет конкретно определить степень участия насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Однако морфология жировой болезни печени не позволяет конкретно определить степень участия насыщенных жирных кислот в развитие этого процесса.

Есть другой информации  установления диагноза жировой болезни печени [5], включающий исследование количество липидов в сыворотке крови. Сущность данного исследования заключается  в том, что основной причиной развития ожирения является повышенное содержание в печени свободных жирных кислот. В данной работе  авторы не использовали метода газовой хроматографии и там не определено содержании жирных кислот каждого по отдельности. В сыворотке крови у больных жировой болезни печени,  а так же не определенно количество отложившихся триглицеридов  в гепотоцитах.  В связи с этим не проведено газохроматографические анализ составляющий компонентами триглицеридов,  т. е  из   какие высшие жирные кислоты составляются эти триглицериды.

 Результаты определения содержания высших жирных кислот в сыворотке крови здоровых лиц  и больных неалкогольным  жировой болезни печени представлены в таблице. Показано что у здоровых людей среди насыщенных жирных кислот 29% составили  пальмитиновой (С_16:0 19,50%)и стеариновая (С_18:0 9,50%), причём процентное содержания пальмитиновой было почти в 2 раза выше, чем стеариновой.

Что касается мононенасыщенных жирных кислот, в основном преобладала олеиновая кислота (С_18:1),содержание которой составляло 24,05%. Из полиненасыщенных жирных кислот в основном было повышена концентрация  линолевой (С_18:2) и арахидоновой (С_20:4) кислот, она составляла 22,18 и 8,8% соответственно. Данные таблица свидетельствует, что содержание насыщенных жирных кислот в сыворотке крови больных оказалось повещенным по сравнению с контролем и составило в среднем 36,71±1,75 и 36,57±1,78% от общей суммы высших жирных кислот, среди которых преобладали  пальмитиновая  (С_16:0 22,65± 0,79%) и стеариновая (С_18:0 14,06±0,82%) кислоты. Отмечено также заметное повышение концентрации мононенасыщенной олеиновой кислоты: 33,31±1,34  и   33,46±1,31.

 Если обратить внимание на содержания полиненасыщенных жирных кислот на примере линолевой, и арахидоновой кислот, то их сумма в среднем составляет 27,82 ± 1,22 % а в случае стеатогепатитом 30,01±1,32%. Как видно содержание линолевой кислоты снижается до 10,07±0,13   линоленовой - до 5,79±0,08 и  арахидоновая – до 11,78±0,37%.

 В случае стеатогепатите содержания линолевой кислоты составляет 6,99±0,09,  линоленовой  -7,96±0,11  и арахидоновой 15,06±0,50% см. табл. На рис.1 приведена контрольная хроматограмма высших жирных кислот. На основе проведенных исследованием можно отметить, что у больных жировой болезни печени по сравнению с контролем значительно возрастало содержание насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот. На основе полученных данных табл. построен график зависимости уровня жирных кислот от стадии заболевания. (Рис 2.)
Таблица 1- Содержания жирных кислот в сыворотке  крови здоровых   лиц и больных НАЖБИ и НАГС (в  % от общего содержания, М±m)

Рис.1 - Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот в сыворотке крови    у здоровых людей. 1. С_10:0, 2.С_14:0, 3.С_15:0,  4.С_16:1, 5.С_16:0, 6.С_17:1, 7.С_18:0, 8.С_18:0, 9.С_18:1, 10.С_18:2 , 11. С_18:3, и 12 С_20:4

Это явление можно охарактеризовать следующем  образом: при снижение скорости окисления содержания свободных  насыщенных жирных кислот увеличивается их концентрация в печени, что приводит к отложению избыточного количества триглицеридов в гепотоцитах, и в результате чего происходит накопление большого количества липопротеидов очень низкой плотности. В этом случаи отложившейся триглицериды образуются в основном из насыщенных жирных кислот. Результаты газохроматографического анализа свидетельствуют о тесной связи развития неалкогольной жировой болезни печени с абдоминальным процессом, так что ожирение печени можно объяснить увеличенным поступлением  насыщенных жирных кислот непосредственно к печени по воротной вене. На основе полученных результатов построен график зависимости содержания высших жирных кислот сыворотке крови больных неалкогольной жировой болезни печени.

Рис.2 - График  зависимости содержания высших жирных кислот сыворотке крови от стадии  заболеваемости при неалкогольной жировой болезни печени.

Таким  образом,  полученные  результаты являются достоверными и можно использовать,   в качестве дополнительного теста с целью постановке точным диагнозом и эффективного лечения больных неалкогольной жировой  болезни печены.

Экспериментальная часть

Сущность работа заключается в том, что  газохроматографическим  методом устанавливают содержание высших жирных кислот в сыворотке крови, а именно в пробирку заливают,  0,25 мл сыворотке кровы добавляют,  5 мл хлороформ- метанольную смесь в соотношении 2:1, и взбалтывают в течение 10 минут. Далее фильтруют и после добавления 0,5мл дистиллированной воды смесь центрифугируют в течение 10 минут. После чего  хлороформной  экстракт отделяют и выпаривают досуха. Затем в содержимое колбу добавляют 2мл  абсолютного   метанол и одной каплей  концентрированной серной кислоты метилируют в течение 30 минут. Содержимое колбы дважды экстрагируют  смесью гексан эфиром в соотношение (1:1). Экстракт промывают, водой  сушат над сульфатом натрия. Затем экстракт фильтруют и после удаление растворителя остаток растворяют в 0,2мл этилового спирта и хроматографируют.

Условия хроматографирования. Колонку длиной 1,26м с внутренним диаметром 0,3см заполняли фазой N-AW диаметром зернения 0,160-0,200мм, содержащий   3% SE-30. Nr-160   ⁰C,  испарителя -280⁰C, детектора-270⁰ С, скорость газ носителя- 40 мл/мин,  скорость водорода 30мл/мин,  скорость движения  ленты  самопица-0,6 см/мин,  продолжительность  анализа 45 мин. Анализ проводили в режиме линейного программирования при скорости поднятия температуры 4⁰ С/мин. Термостат колонки при (150-240⁰С).