СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА

Научная статья

Омарова С.М.^1, *, Исаева Р.С.², Ахмедова Р.С.³, Акаева Ф.С.⁴, Саидова П.С.⁵, Багандова Д.Ш.⁶, Муслимов М.О.⁷

^1–7 Дагестанский государственный медицинский университет», Махачкала, Россия

* Корреспондирующий автор (omarovanpo[at]mail.ru)

Аннотация

Выделение Listeria monocytogenes из клинического материала при акушерско-гинекологической патологии часто затруднено вследствие присутствия микробов-ассоциантов. В настоящем исследовании представлены материалы изучения новых отечественных питательных сред для выделения листерий при микробиологической диагностике листериоза беременных. Показана диагностическая эффективность разработанных питательных сред в лабораторной диагностике микст-инфекций у женщин с акушерско-гинекологической патологией.

Ключевые слова: Listeria monocytogenes, листериоз беременных, выделение, питательные среды, микробы-ассоцианты, ингибиция.

IMPROVING THE METHODS OF MICROBIOLOGICAL DIAGNOSIS OF MIXED INFECTIONS IN WOMEN OF REPRODUCTIVE AGE

Research article

Omarova S.M.^1, *, Isaeva R.S.², Akhmedova R.S.³, Akayeva F.S.⁴, Saidova P.S.⁵, Bagandova D.Sh.⁶, Muslimov M.O.⁷

^1–7 Dagestan State Medical University, Makhachkala, Russia

* Corresponding author (omarovanpo[at]mail.ru)

Abstract

The isolation of Listeria monocytogenes from clinical material in obstetric and gynecological pathology is often difficult due to the presence of associated microbes. This study presents the materials of the study of new domestic nutrient media for the isolation of listeria in the microbiological diagnosis of listeriosis in pregnant women as well as demonstrates the diagnostic effectiveness of the developed nutrient media in the laboratory diagnosis of mixed infections in women with obstetric and gynecological pathology.

Keywords: Listeria monocytogenes, listeriosis in pregnant women, isolation, culture media, associated microbes, inhibition.

В последние годы все больше внимание исследователей и врачей различных специальностей привлекают оппортунистические инфекции, проблема диагностики которых до настоящего времени не решена. К возбудителям таких инфекций в полной мере относятся и листерии, вызывающие развитие листериоза – заболевания, характеризующегося широким спектром клинических проявлений [2], [6].

Листериозная инфекция наибольшую опасность представляет для беременных женщин и новорожденных, обуславливая выкидыши, мертворождения, пороки плода. В большинстве случаев в связи с запоздалой диагностикой листериоза беременных наблюдается трансплацентарное инфицирование плода, и беременность, по средним данным, в 22% заканчивается абортом или мертворождением [6], [7]. Преждевременные роды в этих случаях являются обычным явлением, так же как развитие заболевания у новорожденных. Вместе с тем исследование клинического материала при появлении симптомов листериоза у беременных, позволило бы выявить его истинный удельный вес в структуре прерывания беременности. Для листерий, как и для других факультативных внутриклеточных паразитов, главную роль играет клеточный иммунитет, снижение которого во время беременности, повышает восприимчивость к листериозной инфекции у пациентов данной группы риска [3], [6], [7].

Полиморфизм клинических проявлений, а также нередкое сочетание L. monocytogenes с другими микроорганизмами, значительно затрудняет клиническую диагностику листериозной инфекции, поэтому приоритет в этой области имеет бактериологический метод исследования с использованием селективных питательных сред. Посев на плотные питательные среды («Золотой стандарт») по-прежнему остается ведущим методом исследования, позволяющим выделить, идентифицировать и изучить возбудитель инфекции [1], [4], [6], [8].

Цель исследования - изучение диагностической эффективности отечественных питательных сред и различных лабораторных методов исследования при микробиологической диагностике перинатального листериоза.

Материалы и методы

Материалом исследования служили мазки и соскобы из цервикального канала, взятые с соблюдением всех правил забора материала для исследования, которые были изучены бактериологическим, серологическим методами, а также методом ПЦР-диагностики [1], [4], [5].

Комплексное обследование включало обязательную микроскопию мазка по общепринятому методу (окраска по Граму) и количественный посев на расширенный набор питательных сред с культивированием в аэробных условиях в течение (18±2) ч при температуре (37±1)⁰С.

Было обследовано 652 беременных женщин, находившихся на учете в кабинетах бесплодия женских консультаций г. Махачкалы. Все женщины были в активном репродуктивном возрасте (20-35 лет). Из них у 60% обследованных было диагностировано вторичное бесплодие с привычными выкидышами (58%) и мертворождаемостью (42%). У 40% обследованных женщин установлены диагнозы: эрозия шейки матки (46%), кольпиты (19%), эндометриты (15%), вагиниты (7%) и вагинальный кандидоз (13%). У всех женщин данной группы в акушерском анамнезе отмечалось невынашивание беременности.

Для обнаружения в клиническом материале L. monocytogenes использовали отечественные питательные среды для накопления, выделения и идентификации листерий (ФГУП «Микроген» НПО «Питательные среды», г.Махачкала).

Учитывая, что как правило, сопутствующая микрофлора при акушерско-гинекологических инфекциях представлена бактериями рода Enterobacteriaceae, как то E.coli, Klebsiella spp, Proteus spp, а также Candida albicans, рост которых на разработанных селективных средах для листерий полностью подавлялся, для выделения названных микроорганизмов параллельно использовали известные коммерческие среды Эндо, Левина, Кандида-агар, амфолан-агар (для выделения Рroteus), что позволяло сократить время бактериологического исследования и ускорить процесс выявления возбудителя инфекции у обследованной группы беременных женщин.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования клинического материала показали, что в большинстве случаев обнаруживалась смешанная микрофлора, представленная сочетаниями листерий с микроорганизмами различной природы (бактерии, грибы, вирусы).

Во всех случаях клинического проявления листериозной инфекции при посеве на питательной среде для накопления наблюдали помутнение бульона, на среде для выделения листерий был отмечен рост мелких бесцветных колоний в S-форме, блестящих, голубоватых при исследовании в проходящем свете. На среде для первичной идентификации листерий через (18±2) ч был выявлен рост колоний черного цвета, блестящих, влажных в S-форме, d=1,0±0,2 мм.

У обследованных групп женщин выделено и идентифицировано до вида 24 штамма L. monocytogenes (21,4 %), из которых установлен диагноз мертворождаемость в 14 случаях, а в 10 случаях диагноз невынашивание. Все они имели в анамнезе 2 и более выкидыша в большом сроке беременности (21-25 недель).

Результаты серологических исследований показали, что все 24 выделенных возбудителя относились к L. monocytogenes серогруппам 4в и 1/2а, и давали реакцию агглютинации на «+++» или «++++».

Принадлежность 24 изолятов к виду L. monocytogenes подтверждена в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами. Остальные представители рода Listeria дали отрицательный результат в ПЦР.

Выделенные штаммы листерий были испытаны с целью определения их чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом. В работе использовали коммерческие диски с антибиотиками (производства НИЦФ, г.Санкт-Петербург). Антибиотикограмму листерий изучали путем посева выделенных культур L. monocytogenes (по 2,0 мл инокулята из стандартного разведения 10⁹) на питательную среду АГВ для определения чувствительности к антибиотикам (производства НПО «Питательные среды»). В опыт были взяты антибиотики, наиболее часто используемые в терапии листериоза. Результаты антибиотикограммы показали, сто листерии высокочувствительны к линезолиду (МИК составляла 60,0 мкг/мл) и рифампицину; чувствительны к пенициллину, ванкомицину, ампициллину, гентамицину и эритромицину; устойчивы к налидиксовой кислоте.

Из представителей сопутствующей бактериальной флоры чаще всех выявлялись E. coli – 41,8%, микроорганизмы рода Klebsiella spp. - в 28,7%, S. faecalis - в 4,5% и грибы рода Candida - в 5,1%. Бактерии других родов обнаруживались реже.

Большинство выделенных культур вызывали гемолиз эритроцитов (на кровяном агаре) особенно часто этот признак отмечали у L. monocytogenes (95%), у E. coli (70,0%), P. vulgaris (28,0%), S. marcescens (25,0%), Klebsiella spp. (50 %), Staphylococcus spp. (25%), P. mirabilis (75,0%). Тест на ДНК-азу у E. coli положительный был в 50,0%, у S. marcescens в 100%, реже ДНК-аза обнаруживалась у бактерий рода Klebsiella spp. (в 10,0%).

Лецитиназная активность выявлена у 30,0% штаммов Proteus. Гиалуронидазу продуцировали почти все выделенные условно-патогенные представители семейства энтеробактерий, например, бактерии родов Klebsiella, Proteus в 100% случаев.

Клинические образцы ДНК, выделенные из соскобов эпителиальных клеток цервикального канала женщин с диагнозами невынашивание и мертворождаемость, были проанализированы на наличие специфических фрагментов при помощи ПЦР-Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis и genitalium, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, HCMV, HSV (1 и 2 титов), HPV (16-18 титов).

Выявляемость возбудителей указанных инфекций методом ПЦР была различной, так в 37% случаев выявлялись хламидии, трихомонады – 21%, папиллома вирус человека – 18%, гонококки – 11%, уреаплазмы – 8%, вирус простого герпеса – 5%. Исследования показали, что из перечисленных вирусов наибольшую этиологическую роль в развитии микст-инфекций, у обследованной группы женщин, играют хламидии (37%).

Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные среды для выделения и культивирования листерий обладали высокой чувствительностью и специфичностью в отношении роста этих возбудителей, а также обеспечивали стабильное сохранение их основных свойств. Выделенные из исследуемого материала листерии были типичными по своим морфологическим и биологическим свойствам: грамположительные палочки; каталазоположительные; обладали подвижностью при 22⁰С; утилизировали эскулин; ферментировали с образованием кислоты рамнозу и маннозу и не ферментировали манит, ксилозу и арабинозу; формировали зону ß-гемолиза на 5 % кровяном агаре; проявляли лецитиназную активность в присутствии активированного угля и желточной эмульсии. Результаты исследований клинического материала показали, что листерии и условно-патогенные энтеробактерии, выделенные с использованием разработанных сред наряду со специфическими инфекциями при акушерско-гинекологической патологии у обследованных групп женщин, обладали рядом факторов, определяющих возможность их участия в патогенезе заболеваний. Данные бактериологических исследований подтверждены методами ПЦР-диагностики и в реакции непрямой иммунофлюоресценции, процент совпадений при использовании 3-х методов составил 98-100%.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Бакулов И.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопрос диагностики и профилактики / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев. Ульяновск, 1991.
2. Долгих Т.И. Лабораторная диагностика – основа информационного обеспечения диагностического процесса при оппортунистических инфекциях / Т.И. Долгих.
3. Ермолаева С.А. Изменения уровня экспрессии факторов вирулентности L. monocytogenes под влиянием внешних условий / С.А. Ермолаева, Ю.Ф. Белый, И.С. Тартаковский // Молекулярно-генетическая микробиология и вирусология, 2000; 1: 17-19.
4. Карпова Т.И. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes / Т.И. Карпова, Ермолаева, И.В. Лопырев и др. // Клин. Микробиол. антимикроб. химиотер. 2001; 1: 80-81.
5. Карпова Т.И. Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности / Т.И. Карпова, Т.Е. Фирсова, Л.В. Родина и др. // Клин. Микробиол. антимикроб. химиотер. 2003; 3: 251-258.
6. Омарова С.М. Микробиологическая диагностика листериозной инфекции (учебное пособие) / С.М. Омарова. Махачкала, 2018, с.40.
7. Омарова С.М. Микробиологические аспекты листериозной инфекции беременных и новорожденных / С.М. Омарова, Р.И. Исаева, Р.С. Ахмедова. Махачкала. 2017, с.63.
8. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологи человека и лабораторная диагностика / И.С. Тартаковский, В.В. Малеев, С.А. Ермолаева. М., «Медицина для всех», 2002.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Bakulov I. A. Listerioz kak pishhevaja infekcija. Vopros diagnostiki i profilaktiki [Listeriosis as a food infection. The question of diagnostics and prevention] / I. A. Bakulov, D. A. Vasiliev. Ulyanovsk, 1991. [in Russian]
2. Dolgikh T. I. Laboratornaja diagnostika – osnova informacionnogo obespechenija diagnosticheskogo processa pri opportunisticheskih infekcijah [Laboratory diagnostics – the basis of information support of the diagnostic process in opportunistic infections] / T. I. Dolgikh. [in Russian]
3. Ermolaeva S. A. Izmenenija urovnja jekspressii faktorov virulentnosti L. monocytogenes pod vlijaniem vneshnih uslovij [Changes in the level of expression of virulence factors of L. monocytogenes under the influence of external conditions] / S. A. Ermolaeva, Yu. F. Bely, I. S. Tartakovsky // Molekuljarno-geneticheskaja mikrobiologija i virusologija [Molecular-genetic microbiology and virology], 2000; 1: 17-19. [in Russian]
4. Karpova T. I. Novye metody identifikacii Listeria monocytogenes [New methods of identification of Listeria monocytogenes] / T. I. Karpova, Ermolaeva, I. V. Lopyrev et al. // Klin. Mikrobiol. antimikrob. himioter [Klin. Microbiol. antimicrob. Chemother]. 2001; 1: 80-81. [in Russian]
5. Karpova T. I. Tipirovanie Listeria monocytogenes na osnove polimorfizma genov faktorov patogennosti [Typing of Listeria monocytogenes on the basis of polymorphism of genes of pathogenicity factors] / T. I. Karpova, T. E. Firsova, L. V. Rodina et al. // Klin. Mikrobiol. antimikrob. himioter [Klin. Microbiol. antimicrob. Chemother]. 2003; 3: 251-258. [in Russian]
6. Omarova S. M. Mikrobiologicheskaja diagnostika listerioznoj infekcii (uchebnoe posobie) [Microbiological diagnostics of listeriosis infection (textbook)] / S. M. Omarova. Makhachkala, 2018, p. 40. [in Russian]
7. Omarova S. M. Mikrobiologicheskie aspekty listerioznoj infekcii beremennyh i novorozhdennyh [Microbiological aspects of listeriosis infection in pregnant women and newborns] / S. M. Omarova, R. I. Isaeva, R. S. Akhmedova. Makhachkala. 2017, p. 63. [in Russian]
8. Tartakovsky I. S. Listerii: rol' v infekcionnoj patologi cheloveka i laboratornaja diagnostika [Listeria: the role in human infectious pathology and laboratory diagnostics] / I. S. Tartakovsky, V. V. Maleev, S. A. Ermolaeva. M., "Medicine for all", 2002. [in Russian]