ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ФИТОПРЕПАРАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PARAMECIUM CAUDATUM

ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ФИТОПРЕПАРАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PARAMECIUM CAUDATUM

Научная статья

Василиади О.И.^1, *, Кузьминова Е.В.², Семененко М.П.³, Власенко А.А.⁴

¹ ORCID: 0000-0002-7622-8154;

² ORCID: 0000-0003-4744-0823;

³ ORCID: 0000-0001-8266-5900;

⁴ ORCID: 0000-0002-7580-8966;

^{1, 2, 3, 4} Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии, Краснодар, Россия

* Корреспондирующий автор (vasiliadiolga22[at]gmail.com)

Аннотация

В статье приведены результаты изучения мембраностабилизирующей активности фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина с использованием метода биотестирования, при котором оценивалась выживаемость инфузорий Paramecium caudatum. В качестве фармакологического индикатора (токсиканта), преимущественно повреждающего липидную часть мембраны клеток, использовали 3 %-ный пероксид водорода. Экспериментально было подобранно наиболее эффективное соотношение фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина равное 1:10, которое максимально увеличило время сохранения подвижности и целостность клеточной мембраны инфузорий – длительность движения парамеций при этой комбинации составила 4,0 минуты, что в 2,7 раз больше, чем в контроле.

Ключевые слова: фитопрепараты, дигидрокверцетин, силимарин, мембраностабилизирующая активность, биотестирование, парамеции.

A STUDY OF THE MEMBRANE-STABILIZING ACTIVITY OF PLANT-BASED DRUGS USING THE PARAMECIUM CAUDATUM TEST SYSTEM

Research article

Vasiliadi O.I.^1, *, Kuzminova E.V.², Semenenko M.P.³, Vlasenko A.A.⁴

¹ ORCID: 0000-0002-7622-8154;

² ORCID: 0000-0003-4744-0823;

³ ORCID: 0000-0001-8266-5900;

⁴ ORCID: 0000-0002-7580-8966;

^{1, 2, 3, 4} Krasnodar Research Center for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Krasnodar, Russia

* Corresponding author (vasiliadiolga22[at]gmail.com)

Abstract

The current article presents the results of studying the membrane-stabilizing activity of the plant-based dihydroquercetin and silymarin drugs using biotesting, which assessed the survivability of Paramecium caudatum infusoria. 3% hydrogen peroxide was used as a pharmacological indicator (toxicant), which mainly damages the lipid part of the cell membrane. By way of experiment, the study selected the most effective ratio of dihydroquercetin and silymarin drugs, 1:10, which maximized the time of preserving the mobility and integrity of the cell membrane of the infusoria while the duration of movement of the paramecia in this combination was 4.0 minutes, which is 2.7 times more than the control measurements.

Keywords: plant-based drugs, dihydroquercetin, silymarin, membrane-stabilizing activity, biotesting, paramecia.

Введение

Создание и внедрение новых высокоэффективных лекарственных средств является приоритетной задачей ветеринарной фармакологии. Биологическое моделирование, применяемое в фармакологии и токсикологии, предполагает использование культур клеток, лабораторных и экспериментальных животных. Методы оценки, являющиеся альтернативой классическим тестам на животных, такие как экспериментальные модели с использованием культур клеток, находят все более широкое применение в фармако-токсикологических исследованиях. Данные методы позволяют, помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования фармакологических препаратов, прежде всего на стадии их доклинических испытаний [1, С. 3], [8, С. 1573], [9, С. 19].

Наиболее распространенным объектом, используемым для оценки мембраностабилизирующего действия биологически активных веществ, являются инфузории вида Paramecium caudatum. Поверхность инфузорий покрыта ресничками, которые за счет ионных каналов, встроенных в мембрану ресничек, играют роль хеморецепторов и реагируют на растворенные химические вещества, а также формируют двигательную активность парамеций. В результате снижения мембранного потенциала при добавлении токсиканта клетки замедляют свое движение и изменяют траекторию. Мембраностабилизирующую активность изучаемых веществ оценивают по их способности повышать толерантность парамеций к клеточным ядам [2, С. 30], [4, С. 23], [5, С. 476], [7, С. 140].

В настоящее время в связи со значительным распространением гепатопатий у животных разработка новых препаратов, обладающих гепатопротекторными свойствами, сохраняет свою актуальность. В этом аспекте наиболее изучаемым направлением является поиск и применение растительных компонентов, так как они обладают большой фармакологической активностью, но при этом лишены ряда недостатков, свойственных искусственно синтезируемым химическим веществам. К наиболее перспективным фитопрепаратам, обладающим гепатопротекторными и антиоксидантными свойствами, относятся дигидрокверцетин и силимарин [6, С. 97], [10, С. 827].

Цель исследования – изучение мембраностабилизирующей активности фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина на тест-системе Paramecium caudatum. 

Материалы и методы исследований

Исследования проводились в отделе фармакологии Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института. Объекты исследования – фитопрепараты дигидрокверцетина (ДГК) и силимарина. В качестве первого компонента использовался дигидрокверцетин, находящийся в составе кормовой добавки «Экостимул-2» (АО «Аметис»), с содержанием активнодействующего вещества не менее 70 %. Второй компонент был представлен сухим растительным экстрактом расторопши пятнистой с содержанием силимарина не менее 80 %.

Для определения мембраностабилизирующей активности фитопрепаратов использовали суточные культуры Paramecium caudatum, которых культивировали в контейнерах с плотно прилегающей крышкой. Температурный диапазон поддерживался в пределах от 20 ℃ до 26 ℃.

Эксперимент проводился в 2 этапа: на 1 этапе определяли индивидуальную мембраностабилизирующую активность силимарина и дигидрокверцетина; на 2 этапе изучали эффективность от комплексного применения этих веществ. Результаты оценивали по продолжительности двигательной активности инфузорий, их направленного движения и формы клеток. В качестве токсиканта использовалась 3 %-ный раствор перекиси водорода, который расщепляется с образованием свободных радикалов и повреждает преимущественно липидный слой мембраны. Повреждающая концентрация и объем раствора токсиканта были предварительно подобраны экспериментальным путем.

В ходе опыта первого этапа на предметное стекло наносили 4 пробы – в количестве 0,05 мл среды, содержащей Paramecium caudatum (в поле зрения находилось не менее 5 особей). К 3 пробам тангециально добавляли соответствующие объемы исследуемых веществ и выдерживали 10 минут, четвертая проба служила контролем, в ней исследуемые вещества заменили на 0,05 мл дистиллированной воды. После этого ко всем 4 пробам добавляли 0,05 мл 3 %-го раствора перекиси водорода. Затем фиксировали время остановки парамеций в каждой пробе, в результате учитывались средние значения по 3 повторностям [3]. Опыт повторялся для каждого вещества в отдельности, также использовали различные концентрации фитопрепаратов для выявления наибольшей их активности.

На втором этапе эксперимента оценивалась мембраностабилизирующая активность комплекса растительных компонентов, который включал в себя фитопрепараты дигидрокверцетина и силимарина, методика выполнения опыта повторялась без изменений. В таблице 1 отображены комбинации фитопрепаратов с их порядковым номером.

 

Таблица 1 – Номера комбинаций фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина

№ п/п	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Соотношение ДГК : силимарин	Контроль	2:10	2:8	2:7	2:5	1:4	1:6	1:8	1:10	3:5	3:8

 

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ статистического анализа Statistica 6.0.

Результаты исследований

При добавлении в среду с парамециями токсиканта он сразу же проникает через мембрану внутрь инфузории, так как всасывание происходит всей поверхностью ее тела. Токсические вещества, попадающие в клетку, нарушают ее жизнедеятельность, что сказывается и на выделительной системе – число сокращений выделительных вакуолей уменьшается, вплоть до полной блокады их функций. В результате проведенных исследований по оценке мембраностабилизирующей активности фитопрепаратов с использованием 3%-го раствора перекиси водорода установлено, что время остановки движения инфузорий в контрольной пробе составило 1,5±0,08 минут (табл. 2).

 

Таблица 2 – Оценка мембраностабилизирующей активности фитопрепаратов на тест-системе Paramecium caudatum

Фитопрепараты
Дигидрокверцетина		Силимарина
Концентрация, %	Время остановки движения, мин	Концентрация, %	Время остановки движения, мин
0,1	0,83±0,12	4	1,5±0,2
0,01	1,5±0,20	3	1,8±0,2
10 × 10-4	2,0±0,20	2	2,5±0,15
10 × 10-5	2,2±0,17	1	3,0±0,1
10 × 10-6	2,5±0,20	0,1	1,7±0,10
10 × 10-7	3,5±0,22	0,01	1,5±0,15
10 × 10-8	2,5±0,15	10 × 10-4	1,5±0,15

 

Фитопрепарат дигидрокверцетина проявляет наибольшую мембраностабилизирующую активность при концентрации 1×10^-7, а силимарина – при концентрации 1 %, что увеличивает длительность двигательной активности инфузорий в 2 раза по сравнению с контролем.

Результаты оценки мембраностабилизирующей активности комплекса из фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина представлены на рисунке 1.

Из графика видно, что соотношение фитопрепаратов дигидрокверцетина к силимарину равное 1:10 максимально увеличило время сохранения подвижности и целостность клеточной мембраны инфузорий. Так, длительность движения парамеций в этой пробе составила 4,0 минуты, что в 2,7 раз больше, чем в контроле.

Рис. 1 – Мембраностабилизирующая активность комплекса фитопрепаратов ДГК и силимарина

  Заключение

Таким образом, для изучения мембраностабилизирующей активности фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина использовали метод биотестирования, при котором оценивали выживаемость инфузорий Paramecium caudatum. В качестве фармакологического индикатора (токсиканта), преимущественно повреждающего липидную часть мембраны, использовали пероксид водорода 3 %, который расщепляется до перекисных радикалов in vivo, инициирующих процесс перекисного окисления липидов мембран клеток.

Экспериментальным путем было подтверждено наличие у исследуемых веществ мембраностабилизирующей активности. Также было подобранно наиболее эффективное соотношение фитопрепаратов дигидрокверцетина и силимарина равное 1:10, которое позволило сохранить двигательную активность парамеций до 4 минут.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Болезни минеральной недостаточности у сельскохозяйственных животных: лечение и профилактика / М.П. Семененко, Е.В. Кузьминова и др. // Методические рекомендации. Краснодар, 2016. – 44 с.
2. Володина Т.А. Обоснование оптимального состава композиций из растительных экстрактов с использованием биологического теста на парамециях / Т. А. Володина // Омский научный вестник. Серия Ресурсы земли. Человек. – 2012. – № 2 (114). – С. 30-31.
3. Методические рекомендации «Paramecium caudatum – как модель in vitro для изучения биологической активности веществ различной природы» / Н.Г. Иванова, Н.Р. Телесманич, И.Н. Андреева и др. – Ростов-на-Дону – 2001. – 24 с.
4. Митишев А.В. Биологическая оценка резиноида хлореллы с помощью инфузорий Paramecium caudatum / А.В. Митишев, Е.Ф. Семенова, В.П. Величко и др. // Международный научно-исследовательский журнал. – 2016. – № 4 (46) Часть 5. – С. 23-27.
5. Умнова О.А. Сравнение биологической активности фитохимических композиций в нативной и липосомальной формах / О.А. Умнова // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. – 2010. – Т. 51. – № 6. – С. 476-480.
6. Ферсунин А.В. Комплексное использование минерального и растительного сырья для производства лекарственных средств в ветеринарной медицине / А.В. Ферсунин, М.П. Семененко, Е.В. Кузьминова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. – 2014. – № – 51. – С. 97-99.
7. Haga N. Paramecium as a bioassay system for elucidation of cytotoxicity and biocompatibility of nanoparticles: effects of carbon nanofibers on proliferation and survival / N. Haga, K. Haneda // Jpn. J. Protozool. – 2007. Vol. 40 (2). – P. 139-146.
8. Semenenko M.P. Molecules of medium mass as an integral indicator of endogenous intoxication in the diagnosis of hepatopathy and its effect on improving the economic efficiency of veterinary measures in the field of dairy farming / M.P. Semenenko, E.V. Kuzminova, E.V. Tyapkina et al. // Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. – 2017. – Vol. 9. – № 9. – P. 1573-1575.
9. Semenenko M.P. Realization of the bioresource potential of the broiler chickens when using the natural bentonites / P. Semenenko, E.V. Kuzminova, A.G. Koschaev // Advances in Agricultural and Biological Sciences. – 2017. – Vol. 3. – № 1. – P. 19-24.
10. Wilk-Wozniak K.J. The effect of potentially toxic cyanobacteria on ciliates (Ciliophora) / K.J. Wilk-Wozniak, E.K. Wojciech // Hydrobiologia. – 2019. – P. 827.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Bolezni mineral'noj nedostatochnosti u sel'skohozjajstvennyh zhivot-nyh: lechenie i profilaktika [Diseases of mineral deficiency in farm animals: treatment and prevention.] / М.P. Semenenko, Е.V. Kuzminova, А.N. Troshin et al.// Metodicheskie rekomendacii. [Guidelines] Krasnodar, 2016. – 44 P. [in Russian]
2. Volodina T.A. Obosnovanie optimal'nogo sostava kompozicij iz ras-titel'nyh jekstraktov s ispol'zovaniem biologicheskogo testa na paramecijah [Substantiation of the optimal composition of compositions from plant extracts using a biological test on paramecia] / T. A. Volodina // Omskij nauchnyj vestnik. Serija Resursy zemli. Chelovek. [Omsk Scientific Bulletin]– 2012. – № 2 (114). – P. 30-31. [in Russian]
3. Metodicheskie rekomendacii «Paramecium caudatum – kak model' in vitro dlja izuchenija biologicheskoj aktivnosti veshhestv razlichnoj prirody» [Guidelines «Paramecium caudatum - as a model for in vitro study of the biological activity of substances of different nature"] / N.G. Ivanova, N.R. Telesmanich, I.N. Andreeva et al. – Rostov-na-Donu – 2001. – 24 P. [in Russian]
4. Mitishev A.V. Biologicheskaja ocenka rezinoida hlorelly s pomoshh'ju infuzorij Paramecium caudatum [Biological assessment of chlorella resinoid using ciliates Paramecium caudatum] / A.V. Mitishev, E.F. Semenova, V.P. Velichko et al. // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. – 2016. – № 4 (46) Part 4. – P. 23-27. [in Russian]
5. Umnova O.A. Sravnenie biologicheskoj aktivnosti fitohimicheskih kompozicij v nativnoj i liposomal'noj formah [Comparison of biological activity of phytochemical compositions in native and liposomal forms] / O.A. Umnova // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Himija. – 2010. – Vol. 51. – № 6. – P. 476-480. [in Russian]
6. Fersunin A.V. Kompleksnoe ispol'zovanie mineral'nogo i rastitel'nogo syr'ja dlja proizvodstva lekarstvennyh sredstv v veterinarnoj medicine [Complex use of mineral and plant raw materials for the production of medicines in veterinary medicine] / A.V. Fersunin, M.P. Semenenko, E.V. Kuz'minova // Trudy Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. – 2014. – № – 51. – P. 97-99. [in Russian]
7. Haga N. Paramecium as a bioassay system for elucidation of cytotoxicity and biocompatibility of nanoparticles: effects of carbon nanofibers on proliferation and survival / N. Haga, K. Haneda // Jpn. J. Protozool. – 2007. Vol. 40 (2). – P. 139-146.
8. Semenenko M.P. Molecules of medium mass as an integral indicator of endogenous intoxication in the diagnosis of hepatopathy and its effect on improving the economic efficiency of veterinary measures in the field of dairy farming / M.P. Semenenko, E.V. Kuzminova et al.// Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. – 2017. – Vol. 9. – № 9. – P. 1573-1575.
9. Semenenko M.P. Realization of the bioresource potential of the broiler chickens when using the natural bentonites / P. Semenenko, E.V. Kuzminova, A.G. Koschaev // Advances in Agricultural and Biological Sciences. – 2017. – Vol. 3. – № 1. – P. 19-24.
10. Wilk-Wozniak K.J. The effect of potentially toxic cyanobacteria on ciliates (Ciliophora) / K.J. Wilk-Wozniak, E.K. Wojciech // Hydrobiologia. – 2019. – P. 827.