ВЛИЯНИЕ PH-СТАТИРОВАНИЯ НА АНТИБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS

Сультимова Т.Д. ¹, Стоянова Л.Г. ²,

¹ кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, Улан-Удэ, ² доктор биологических наук, профессор, Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

ВЛИЯНИЕ PH-СТАТИРОВАНИЯ НА АНТИБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS

Аннотация

Изучено влияние изменения активной кислотности среды на выход конечных продуктов метаболизма микроорганизмов. Стабилизация уровня рН в процессе ферментации позволило повысить уровень антибиотической активности культуральной жидкости L.lactis ssp. lactis примерно на 30%.

Ключевые слова: L.lactis ssp. lactis, pH-статирование, антибиотические свойства, бактериоцин

Sultimova T.D.¹, Stoyanova L.G.²

¹ PhD in Biology, associate professor, East-Siberian State University of Technology and Management, Ulan-Ude, ² PhD in Biology, professor, Lomonosov’s Moscow State University

INFLUENCE OF PH-STABILIZATION ON ANTIBIOTIC PROPERTIES OF LACTIS ACID BACTERIA LACTOCOCCUS LACTIS

Abstract

The influence of pH-stabilization of the medium on the final products of metabolism of microorganisms were investigated. Stabilization of the pH during the fermentation process has led to improved antibiotic activity of the culture liquid L.lactis ssp. lactis is about 30%.

Keywords: L.lactis ssp. lactis, pH-stabilization, antibiotic properties, bacteriocin

Антимикробные свойства молочнокислых бактерий достигаются вследствие биосинтеза ими перекисей, молочной кислоты с последующим изменением уровня рН, а также биосинтеза веществ белковой природы - бактериоцинов. В настоящее время наиболее известным и разрешенным для использования в качестве биоконсерванта в пищевой промышленности является бактериоцин низин (код Е234), имеющий GRAS cтатус (Generally Recognized As Safe) с 1998 года, т.е. характеризуемый Европейским парламентом как безопасный. Однако известно, что биоактивность природных продуцентов антибиотических веществ низкая, антимикробный спектр действия низиноподобных веществ влияет на рост и развитие, в основном, грамположительных бактерии. Также известно, что эффективность действия низина снижается пищевом сырье от рН выше 5,0, возможна его инактивация протеолитическими ферментами. В связи с этим, исследователи изучают новые пути и способы биосинтеза антибиотических веществ, используя различные модификации известных бактериоцинов с наиболее активными антимикробными свойствами или же пытаются найти новые природные биоконсерванты [2,3,5].

В результате скрининга из коровьего молока, полученного в республике Бурятия, нами изолирован и изучен штамм 194, а методом слияния протопластов двух штаммов с низкой антибиотиксинтезирующей активностью получен высокоактивный штамм F-116. Эти штаммы обладали широким спектром антимикробного и фунгицидного действия, что является новым биологическим свойством для L.lactis ssp. lactis [1,2,3].

Для изучения свойств новых бактериоцинов были проведены исследования по влиянию ингибитора синтеза белка в клетке микроорганизма - левомицетина (100 мкг/мл), препятствующему переносу на рибосомы комплекса аминоацил-тРНК, на образование бактериоцинов изучаемыми штаммами лактококков. При замедлении роста микроорганизмов на 50-60% к концу активной фазы роста и переходе на стационарную фазу в питательной среде, содержащей левомицетин, синтез белка снизился на 70%, а антибиотическая активность культуральной жидкости уменьшилась на 80% - 90%.

Данные исследования дают основание считать, что биосинтез изучаемых бактериоциноподобных комплексов происходит с участием рибосом [2,3].

Результаты изучения их физико-химических свойств, спектральных характеристик позволили предположить, что синтезируемые новыми штаммами L. lactis ssp. lactis вещества, являются новыми уникальными бактериоциноподобными комплексами, ранее не описанными в литературе [1,3].

Биосинтез бактериоцинов – управляемый процесс: путем изменения условий культивирования продуцентов антибиотиков и прежде всего изменением состава питательной среды.

Одним из наиболее значимых параметров при культивировании L. lactis subsp. lactis с целью синтеза бактериоцинов является активная кислотность среды.

Изменение рН питательной среды влияет на активность ферментов микроорганизмов, состояние и число промежуточных продуктов биосинтеза, их диссоциацию, растворимость и другие свойства.

Необходимо подчеркнуть, что сильное подкисление и значительное подщелачивание питательной среды могут задержать развитие лактококков, остановить процесс образования бактериоцина.

В связи с этим, при подготовке питательной среды надо учитывать то, чтобы уровень рН среды по возможности остался в пределах необходимых для развития микроорганизма и биосинтеза антибиотических веществ значений. [3].

Считается, что оптимальным исходным значением рН для биосинтеза бактериоцинов является рН 6,6–6,8, но в процессе роста и развития лактококков значение уровень рН среды снижался до 3,8–4,2, а при таких условиях развития культуры (условия естественного закисления среды) большая часть образовавшегося бактериоцина (80-90%) выделяется в культуральную жидкость («свободный бактериоцин»), а меньшая его часть (10–20%) — остается связанной с клетками лактококка[4].

Данное влияние может проявляться как результат непосредственного воздействия ионов водорода или гидроксильных ионов на клетку или как косвенное действие через изменение степени диссоциации веществ субстрата.

Изучение влияния рН-статирования ферментационной среды на синтез бактериоцина штаммами 194 и F-116 проводили в колбах (объем 450 мл) и в ферментере фирмы LKB (объем 5л) с автоматической стабилизацией уровня рН 1н раствором NaOH на уровне рН 5,9-6,0 при 30°С.

Таблица 1.Влияние рН-статирования на рост Lactococcus lactis ssp. lactis и синтез бактериоцинов штаммами 194 и F-116

Результаты контроля ферментационного процесса с автоматическим рН-статированием на уровне рН 6,0, показали, что при поддержании уровня рН при 5,9 – 6,0, исключающего течение автолитических процессов при закислении среды, накопление биомассы длилось до 9 часов у штамма F-116 и до 12 часов у штамма 194, что коррелировало с накоплением бактериоцинов в культуральной жидкости: уровень антибиотической активности штаммов повысился свыше 30%, (табл. 1). Количество NaOH, пошедшего на подтитровку, было максимальным после трех и до 9 -12 ч ферментации, что соотвествовало активному кислотообразованию.

Добавление СаСО₃ как буферного агента в ферментационную среду в количестве 1,5 % увеличивало антибиотическую активность культуральной жидкости штамма 194 на 20%, дальнейшее увеличение концентрации вещества снизило накопления бактериоцина (табл.2).

Таблица 2. Изменение антибиотической активности культуральной жидкости Lactococcus lactis ssp. lactis 194 на средах с карбонатом кальция

Таким образом, изменение pH питательной среды в большой степени оказывает влияние на биосинтез антимикробных веществ, образующихся в результате метаболизма молочнокислых бактерий. Стабилизация уровня рН в процессе ферментации позволило повысить уровень антибиотической активности культуральной жидкости примерно на 30%.

 

Литература

1. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Цыренов В.Ж. Биологический консервант на основе штамма Lactococcus lactis ssp. Lactis F-116// Вестник ВСГУТУ. - - №5. - С. 91-96.
2. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока// Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т.42. - № 5. - С. 560-568.
3. Стоянова Л.Г. Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование: Автореф. дис.доктора биол. наук. –Москва, 2008. – 28 с.
4. Lu W. Nisin Production by Lactococcus Lactis Subsp. lactis under Nutritional Limitation in Fed-Batch Culture/W. Lu, W. Cong, Z. Cai // Biotechnology Letters. -2004. - № 3. - p. 235-238.
5. Dalié D.K.D., Deschamps A.M., Richard-Forget F. A review: Lactic acid bacteria- Potential for control of mould growth and mycotoxins// Food Control. - 2009. - 21 (4). - р. 370-380.

References

1. Sultimova T.D., Stoyanova L.G., Tsyrenov V.Zh. Biological preservative based on a strain of Lactococcus lactis ssp. lactis F-116 // Herald VSGUTU. 2013. №5. P. 91-96.
2. Stoyanova L.G., Sultimova T.D., Botin S.G., Netrusov A.I. Isolation and identification of bacteriocinproducing strains of Lactococcus lactis subsp. lactis from milk // Applied Biochemistry and Microbiology. 2006. T.42. № 5. P. 560-568.
3. Stoyanova L.G. New bacteriocins from lactococcus and there practicle use: Avtoref. Dis. Doctor biol. Nauk. Moskva, 2008. – 28s.
4. Lu W. Nisin Production by Lactococcus Lactis Subsp. lactis under Nutritional Limitation in Fed-Batch Culture/W. Lu, W. Cong, Z. Cai // Biotechnology Letters. -2004. - № 3. - p. 235-238.
5. Dalié D.K.D., Deschamps A.M., Richard-Forget F. A review: Lactic acid bacteria- Potential for control of mould growth and mycotoxins// Food Control. - 2009. - 21 (4). - р. 370-380.