ВЛИЯНИЕ ОКСИДАНТНОГО СТРЕССА НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА У КРЫС ВИСТАР

Старосельская А.Н.¹, Романовская В.Н.², Жаворонков Л.П.³., Яценко Е.М.⁴.

¹Кандидат биологических наук; ²Кандидат биологических наук;  ³Доктор медицинских наук; ⁴Кандидат биологических наук

Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск, Россия.

ВЛИЯНИЕ ОКСИДАНТНОГО СТРЕССА НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА У КРЫС ВИСТАР

Аннотация

Известно, что ионизирующее излучение является одним из индукторов оксидантного стресса. При слабых повреждающих воздействиях в тканях животных установлены высокая чувствительность и длительность сохранения измененного антиоксидантного статуса и интенсивности процесса перекисного окисления липидов (8,9,10).

Ответная реакция организма на любое неблагоприятное воздействие обусловлена адаптационным синдромом, в развитии которого ключевая роль принадлежит крови, прежде всего системе гемостаза. Изменение оксидантного статуса может вызвать нарушение функционирования системы гемостаза.

Целью исследования явилось сравнительное изучение влияния однократного и пролонгированного ионизирующего излучения с малой мощностью дозы на состояние системы гемостаза животных.

Задачей исследования – влияние оксидантного стресса на различные звенья системы гемостаза.

В опытах на крысах-самцах Вистар массой 230-250 г показано, что пролонгированное γ-облучение в дозах 4,8мкГр и 480 мкГр сопровождается повышением тромбогенного потенциала и может рассматриваться как фактор риска внутрисосудистого свертывания крови. Однократное облучение в дозе 40 мкГр характеризовалось замедлением свертывания крови, наблюдался радиационный гормезис. При однократном облучении в дозе 200 мкГр активировался внутренний механизм свертывания крови, что, по-видимому,  связано с повреждением эндотелия и  изменением его антитромботического потенциала на тромбогенный.

Ключевые слова: тромбогенный потенциал, растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК), диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (ДВС-синдром), радиационный гормезис.

Staroselskaya A.N.¹, Romanovskaya V.N.², Zhavoronkov L.P.³ , Yatsenko E.M. ⁴ .

¹Candidate of Biological Science; ²Candidate of Biological Science; ³Doctor of Medical Science; ⁴Candidate of Biological Science

Federal State Institution “Medical Radiological  Research Center” Ministry of Health of the Russian Federation, Obninsk, Russia

EFFECT OF OXIDATIVE STRESS ON HEMOSTATIC SYSTEM IN WISTAR RATS

Abstract

Ionizing radiation is known to be one of the oxidative stress –inducing factors.   High sensitivity to the stress,  long-term retention of  antioxidative status, high- intense  lipid peroxidation are observed in rats with slight radiation-induced damage (8,9,10).

Response to any unfavorable exposure is caused by the adaptive syndrome, and the blood takes a  key part, primarily  in hemostatic system , in the development of this syndrome. Alteration of oxidative status may cause malfunction of  hemostatic system.

The purpose of the research is experimental study of effect of prolonged and single exposure with low dose-rate on hemostatic system.

The task of research is  to clarify the impact of oxidative stress on different chains of the  hemostatic system.

The experiments were performed with the use of  Wistar rats, male,  with mass of 230-250 g.   The study demonstrates that prolonged gamma-radiation  at doses 4.8 and 490 μGy causes a rise of thrombogenic potential, which  can be considered as risk factor of  intravascular   coagulation. Single irradiation with dose of  40 μGy causes  retardation of  the blood. Radiation hormesis is observed.   After irradiation with dose of 200 μGy intrinsic mechanism of the coagulation activates , this may be caused by endothelial damage  and displaying   antithrombogenic potential  for thrombogenic potential.

Keywords:  thrombogenic potential;  soluble fibrin monomer  complexes;   disseminated intravascular coagulation,    radiation hormesis

В опытах использовали крыс-самцов Вистар, массой 220-250г. Подопытных крыс подвергали однократному и пролонгированному g-облучению на установке «Эксперимент» панорамного типа с источником Cs¹³⁷. Однократное облучение в дозах 40 мГр и 200 мГр осуществляли в течение одних суток при мощности дозы -  27,7 мкГр/мин и 138,9мкГр/мин, соответственно. Пролонгированное облучение животных в дозе  4,8 мГр  проводили  в течение 4 суток по 4,5 часа в день со средней мощностью дозы 4,4 мкГр/мин. На этой же установке при мощности дозы 115,9 мкГр/мин крыс облучали в течение 3 суток по 23 часа в день, суммарная доза составила 480 мГр. Контролем служили клинически здоровые животные, содержащиеся в стандартных условиях вивария. По окончании воздействия под наркозом (тиопентал натрия - 35 мг/кг) забирали кровь у крыс из брюшного отдела аорты, стабилизируя ее 3,8% раствором лимоннокислого натрия в отношении 1:9. Тесты на протромбиновое, тромбиновое  и активированное частично тромбопластиновое время (АЧТВ) выполнялись на турбидиметрическом гемокоагулометре CGL-2110 «Solar» (Беларусь) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя наборов реагентов (НПО «Ренам»). Определение  концентрации фибриногена, содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), фибринолитическую активность крови эуглобулиновым методом и АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов проводили согласно описанию (1).

Полученные результаты обработаны методом вариационной статистики (6), а также критерия χ2.

Анализ полученных данных показал (таблица 1), что в системе гемостаза после воздействия даже малой поглощенной дозы 4,8 мГр наблюдались изменения. Выявлена гиперкоагуляционная направленность по укорочению тромбинового времени. В ответ на усиленное тромбообразование резко активировался фибринолиз и регистрировали появление фибрин-мономерных комплексов, которые являются маркерами внутрисосудистого свертывания крови. Генерализованная гиперактивация фибринолиза может сама по себе являться индуктором  ДВС-синдрома, приводя к повреждению факторов свертывания и коагулоп1атии потребления.

На фоне признаков активации  гемостаза АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов была в пределах нормы. Протромбиновое время изменялось в сторону гипокоагуляции. Полученные результаты позволяют заключить, что пролонгированное  γ–облучение в дозе 4,8 мГр вызывает   дисбаланс свертывающих механизмов крови у крыс с появлением признаков внутрисосудистого свертывания крови.

При длительном сроке активации системы гемостаза возникает риск снижения кровотока из-за образования тромбов и развития некроза окружающих тканей. Так, по литературным данным,  при хроническом g-облучении в малых дозах деструктивные изменения проявлялись в органах эндокринной системы  в виде сосудистых расстройств, дистрофических изменений в клетках, локальной их гибели, переходящей в некоторых случаях в очаги некроза тканей (2).

Таблица 1 - Показатели системы гемостаза у крыс Вистар после воздействия разных поглощенных доз  g-облучения  (M ± m)

Примечание:

*- достоверное различие с интактным контролем (Р < 0,05);

** - то же по РФМК (Р < 0,01),  в скобках концентрация фибрин-мономерных комплексов в баллах. В группах от 7 до 20 животных.

Есть данные, что облучение в малых дозах приводит в ближайшие и отдаленные сроки к нарушению функции сердечно-сосудистой системы и повышает ее чувствительность к действию факторов нерадиационной природы (4).

Исследование параметров гемостаза у животных после пролонгированного g-облучения в дозе  480 мГр также сопровождалось разнонаправленными сдвигами: наблюдалось угнетение внешнего механизма свертывания крови, протромбиновое время достоверно удлинялось. Одновременно регистрировалось ускоренное образование фибрина по укорочению тромбинового времени, повышение концентрации фибриногена и увеличение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в 1,2 раза по сравнению с контролем. Реакция на РФМК была слабоположительной. Наблюдалась активация фибринолиза,  что, по-видимому,  является компенсаторной реакцией организма, направленной на восстановление сосудистой проходимости, так как агрегация форменных элементов крови нарушает характер микроциркуляторного кровообращения.

Оценка показателей системы гемостаза при  однократном (в течение одних суток)   g-облучении животных в дозе 40 мГр выявила достоверное удлинение АЧТВ и тромбинового времени, что говорит о гипокоагуляционной направленности и возможно связано с увеличением антикоагулянтов в плазме. Фибрин-мономерные комплексы не выявлялись. Наблюдался неспецифический эффект воздействия на организм, который был  диаметрально противоположен  повреждающему действию больших доз в первые часы и сутки после облучения. Известно, что у облученных в высоких дозах животных в первые часы и сутки после облучения, система гемостаза находится в активированном состоянии [9]. Таким образом,   при  однократном g-облучении  животных  в  дозе  40 мГр наблюдались изменения,  характерные для радиационного  гормезиса.

Однократное   g-облучение животных в дозе 200 мГр сопровождалось активацией коагуляционного гемостаза: АЧТВ было достоверно укорочено, одновременно наблюдалось замедление тромбинового времени, снижение концентрации фибриногена и регистрировали незначительное количество  РФМК. Нарушений со стороны тромбоцитарного гемостаза не было. Эти изменения проходили на фоне депрессии фибринолиза. Снижение фибринолитической активности плазмы представляет потенциальную опасность тромбообразования.

Представленные данные свидетельствуют о том, что существуют различия функционирования системы гемостаза при  g-облучении в разных диапазонах малых доз, которые проявляются в различной степени агрегации тромбоцитов, свертываемости крови и ее фибринолитической активности. Пролонгированное  g-облучение животных в дозе 4,8 мГр вызывало функциональную дезорганизацию системы гемостаза, с появлением признаков внутрисосудистого свертывания крови. Аналогичные изменения в коагуляционном гемостазе наблюдались и при g-облучении в дозе 480 мГр.  Отличительной особенностью было повышение концентрации фибриногена и активация сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Однократное - γ-облучение животных в дозе 40 мГр  характеризовалось  замедлением свертывания крови. Наблюдался радиационный гормезис.

Облучение животных в дозе 200 мГр (однократно) вызывало активацию внутреннего механизма свертывания крови.

Из литературных данных известно, что однократное g-облучение в низкой дозе в течение двух суток стимулирует окислительный стресс, проявляющийся в интенсификации перекисного окисления липидов и нарушении структурной организации мембран клеток крови, печени и мозга мышей линии АКК (7). Увеличивается микровязкость мембран при возникновении в них повреждений за счет индукции активных форм кислорода облучением в малых дозах (11). Активация внутреннего механизма свертывания крови при облучении в дозе 200 мГр, по-видимому, вызвана повреждением эндотелия, так как подэндотелиальные структуры являются потенциальными источниками тканевого фактора, который является основным триггером запуска внутрисосудистого свертывания крови (3).

Из приведенных выше данных следует, что выявленное при воздействии ионизирующей радиации в малых дозах повышение тромбогенного потенциала может говорить о наличии риска развития тромбоза, поэтому целесообразен контроль за системой гемостаза при данных стрессорных факторах.

Литература

1. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Б.И. и др. Лабораторные методы     исследования системы гемостаза. – Томск, 1980. – 314 с.
2. Ермакова О.В.Структурно-функциональные изменения органов эндокринной системы мышевидных грызунов в условиях повышенной радиоактивности среды обитания. – Международная конференция БИОРАД -  2006. Биолигические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды. Сыктывкар 28 февраля – 3 марта 2006г./ Тезисы доклада. – С. 83-84.
3. Заболотских И.Б., Синьков С.В., Шапошников С.А. Диагностика и коррекция расстройств системы гемостаза. – М., Практическая медицина. – 2008. - 331 с.
4. Последствия Чернобыльской катастрофы в Республике Беларусь, Национальный доклад /под ред. Акад. Е.Ф.Конопли, проф. Ролевича . – Министерство по чрезвычайным ситуациям и защите населения от последствий катастрофы на Чернобыльской АЭС. Республика Беларусь, Академия наук Беларуси. – 1996. –  96 с.
5. Радиация и гемостаз/ под ред.заслуженного деятеля науки РСФСР проф. В.П.Балуды. –М., Энергоатомиздат, 1986. – 159 с.
6. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. – М.Наука. 1963. – 323  с.
7. Фаткулина Л.Д., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. Структурные нарушения клеточных мембран в организме лейкозных животных при действии малых доз g - облучения. – С. 125-126.
8. Шишкина Л.Н., Кудяшева А.Г., Загорская Н.Г. др. Показатели антиоксидантного статуса…/ Радиац. Биология. Радиоэкология., 2005, - Т. – 45. – Вып.4. – С. 505-511.
9. Шишкина Л.Н., Кушнирева Е.В., Беспалько О.Ф., Полякова Н.В. Роль антиоксидантного статуса …// Радиац. Биология. Радиоэкология., 2000. – Т.40. – Вып.2.-С.162-167.
10. Шишкина Л.Н., Смотряева М.А. Связь повреждения мембраны и ДНК …// Биофизика, 2000.-Т.45.-Вып.5.-С.844-852.
11. Эйдус Л.Х. Мембранный механизм биологического действия малых доз. – М.:Изд-во ИТЭФ РАН, 2001. – С. 22 – 32.