ЭКСТРАКТ ИЗ ОСЕЙ СОЦВЕТИЙ АРАЛИИ МАНЬЧЖУРСКОЙ —СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СТРЕССОВЫХ НАРУШЕНИЙ ЭРИТРОЦИТОВ

Момот Т.В.

Доцент, кандидат медицинских наук, Школа биомедицины, Дальневосточный федеральный университет

ЭКСТРАКТ ИЗ ОСЕЙ СОЦВЕТИЙ АРАЛИИ МАНЬЧЖУРСКОЙ —СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СТРЕССОВЫХ НАРУШЕНИЙ ЭРИТРОЦИТОВ

Аннотация

Показано, что действие стресса сопровождалось нарушением размерных характеристик эритроцитов и их осмотической резистентности, системы антиоксидантной защиты, соотношения фосфолипидных фракций в мембранах. Экстракт из осей соцветий Аралии маньчжурской оказался более эффективным в восстановлении исследованных физиолого-биохимических параметров эритроцитов, чем эталонный стресс-протектор «Экстракт элеутерококка». Применение препаратов к ежедневной диете позволит решить проблему профилактики стрессорных заболеваний.

Ключевые слова: стресс, эритроциты, аралия, элеутерококк.

Momot T.V.

associate professor, candidate of medical sciences, Biomedicine School of Far East Federal university

EXTRACT FROM AXES OF INFLORESCENCES OF ARALIA MANDCHURICA – MEANS FOR PREVENTION OF STRESSFUL STRUTURAL CHANGES OF ERYTHROCYTES

Abstract

It is shown, that stress was accompanied by violation of dimensional characteristics of erythrocytes and their osmotic resistance, system of antioxidant protection, a ratio of phospholipids fractions in membranes. Effect of extract from axes of inflorescences of an Аralia мandchurica appeared more effective in restoration of the studied fiziologo-biochemical parameters of erythrocytes, than at reference a stress protector «Extract eleutherococcus». Addition of extract aralia or extract eleutherococcus to a daily diet or in the structure of food stuffs will allow to solve a problem of prevention of stressors diseases.

Keywords: stress, erythrocytes, aralia, eleutherococcus.

Стресс-реакция является средством, направленным на адаптацию организма к изменяющимся условиям среды. Однако при сильном и длительном его воздействии в организме возникают различные повреждения, называемые стрессорными заболеваниями или болезнями адаптации (язвы желудочно-кишечного тракта, гипертоническая болезнь, атеросклероз и др.). При стрессе образуются семихинонные радикалы адреналина, инициирующие свободно-радикальные реакции с образованием супероксидного радикала. При хроническом стрессе происходит активация перекисного окисления липидов и рассогласование каскада химических реакций антиоксидантной системы [2]. В результате нарушается соотношение липидных компонентов мембран, повышается их текучесть, что обусловливает увеличение среднего объема и диаметра эритроцита, развитие макроцитоза [4]. Мембрана эритроцита – биологическая модель для изучения стрессовых нарушений в структуре мембран, а перспективными антиоксидантами являются природные полифенольные соединения [12]. Природные ресурсы Дальнего Востока предоставляют широкие возможности для создания разнообразных фитопрепататов. Известны природные стресс-протекторные препараты (адаптогены): корни женьшеня, элеутерококка, аралии, родиолы розовой, семена лимонника и др. Однако неконтролируемый сбор сырья (корни, семена) обусловил истощение запасов этих растений, что определило необходимость исследования полифенольного состава отходов от переработки дикорастущих растений Уссурийской тайги (оси соцветий, кожица, косточки, отжим после отделения сока, листья и др.). Так, в экстракте из осей соцветий Аралии маньчжурской (Aralia mandshurica Rupr. et Maxim), экстракт корней которой используется как известный стресс-протекторный препарат, присутствует комплекс полифенольных соединений флавоноидной природы: катехины, флавонолы, лейкоантоцианы и ряд других органических соединений. Целью работы явилось изучение профилактического влияния экстракта из осей соцветий Аралии маньчжурской при моделировании у животных острого стресса.

Материалы и методы. Измельченное сырье экстрагировали методом реперколяции 40% этиловым спиртом при соотношении сырья к экстрагенту 1:1 (по объему). В процессе реперколяции на 1 кг сырья выход экстракта составлял 1 л. Полученный экстракт упаривали в вакууме до сухого остатка и ресуспендировали в воде. Содержание общих полифенолов (ОПФ) определяли с помощью реактива Фолина-Чокальтеу [11]. Полифенолы составляют 11% от сухого остатка экстракта. В качестве препарата сравнения использовали полифенольный комплекс из аптечного экстракта элеутерококка – широко известного стресс-протектора. Препараты вводили животным внутрижелудочно через зонд 2 раза в течение эксперимента (до вертикальной фиксации и через 4 часа после). Водные растворы сухого остатка экстракта аралии и экстракта элеутерококка (предварительно освобожденные от спирта путем упаривания в вакууме) вводили в количестве 100 мг общих полифенолов/кг массы тела. [3].

Эксперимент проводили на белых крысах-самцах линии Вистар с массой тела 180-200 г., содержащихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания. Стресс вызывали путем вертикальной фиксации животных за дорзальную шейную складку на 24 часа. Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс в каждой: 1-я-контрольная (интактные животные), 2-я - стресс, 3-я - стресс +экстракт аралии, 4-я – стресс+экстракт элеутерококка. Крыс выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН. Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3,0 (Graf Pad Software Inc. USA, 2005) со встроенной процедурой проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Кровь для исследований собирали из шейной вены животных в вакуэты с 1% раствором гепарина. Средний диаметр и объем эритроцита определяли на гематологическом анализаторе «Abacus» (Diatron, Австрия). Осмотическую резистентность эритроцитов к изменению концентрации NaCI рассчитывали по методу Б.Л. Эндрю [6]. Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1), уровень малонового диальдегида и восстановленного глутатиона оценивали по методам, описанным в руководстве Т.П. Новгородцевой и др. [5]. Эритроцитарную массу получали трехкратным центрифугированием в физрастворе. Мембраны эритроцитов - путем гемолиза эритроцитов в дистиллированной воде. Экстракты общих липидов из мембран эритроцитов выделяли по методу J. Folch et al. [8]. Определение общих фосфолипидов и их фракционное разделение осуществляли методом двумерной микротонкослойной хроматографии [13]. Количественное определение холестерина проводили методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле [7].

Работа поддержана Министерством образования и науки, проект № 1326.

Результаты и обсуждение. Вертикальная фиксация крыс за дорзальную шейную складку вызывала формирование типичной картины стресса с характерными геморрагическими деструкциями желудка и гипертрофией надпочечников, масса которых повысилась на 42% (8,43±0,25 мг/100 г массы против 5,94±0,55 мг/100 г массы в контроле, р<0,001). Количество изъязвлений на слизистой желудка составило 2,7±0,08 ед/жив., в контроле 0. Изучение размерных характеристик эритроцитов показало, что при стрессе происходит увеличение среднего диаметра эритроцитов (СДЭ) на 23% (р<0,001), что составляло 8,00±0,07 мкм по сравнению с 6,48±0,02 мкм в контроле. Также увеличился средний объем эритроцитов (СОЭр) до 102,4±2,43 мкм³ (в контроле 54,42±1,93 мкм³; р<0,001), что определяет развитие макроцитоза. При этом начало и завершение гемолиза эритроцитов происходило раньше, чем у контрольных крыс (начало при концентрации NaCI 0,50±0,02%, а завершение – при 0,45±0,02%). В контроле начало гемолиза происходило при 0,45±0,01%, а завершение при 0,35±0,01% NaCI. Стресс сопровождался снижением количества общих фосфолипидов до 50,96±1,80%, что на 21% (р<0,001) меньше контрольных значений (64,82±1,41%). Исследование уровня холестерина в эритроцитах показало, что его содержание превышало контрольный уровень на 29% (р < 0,01) и составляло 31,10±1,40% по сравнению с 24,00±1,38% в контроле. В связи с этим увеличился коэффициент ХС/ФЛ до 0,61±0,01 (в контроле 0,37±0,02; р < 0,001), который свидетельствует о повышении жесткости мембран и снижении их лабильности. Активность супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах при стрессе возросла на 46% (19,70±0,66 ед/мг белка против 13,49±0,57 ед/мг белка в контроле; р < 0,001). При этом величина восстановленного глутатиона (Г-SH) снизилась на 37% (1,06±0,07 нмоль/мг белка по сравнению с 1,69±0,08 нмоль/мг белка в контроле; р<0,001). Такое соотношение компонентов системы антиоксидантной защиты предполагает ее напряжение и тенденцию к истощению. Активация перекисного окисления липидов подтверждается тем, что величина малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах крыс при стрессе была на 36% выше, чем таковая в контроле (7,63±0,31 мкмоль/мл против 5,62±0,17 мкмоль/мл в контроле; р < 0,001). Стресс сопровождался изменениями в фосфолипидном спектре мембран эритроцитов (таблица).

Таблица 1 - Влияние растительных препаратов на содержание фракций фосфолипидов в мембранах эритроцитов крыс при стрессе (в % от суммы всех фракций; M±m)

Фракции фосфолипидов	1 группа Контроль (интактные)	2 группа Стресс	3 группа Стресс+ экстракт аралии	4 группа Стресс+ элеутерококк
Фосфатидил-холин	36,12±0,86	32,68±0,592	37,78±0,83	34,11±0,921
Лизофосфатидил-холин	9,47±0,15	10,98±0,223	8,70±0,40	8,74±0,56
Сфингомиелин	13,20±0,58	16,69±0,463	13,46±0,42	14,80±0,441
Фосфатидилэта-ноламин	18,78±0,71	15,92±0,502	19,23±0,70	19,19±0,81
Лизофосфатидил-этаноламин	7,31±0,46	8,70±0,341	7,15±0,46	7,89±0,44
Фосфатидил-серин	5,73±0,15	4,59±0,123	5,42±0,08	5,40±0,27
Фосфатидил-инозит	5,38±0,12	6,10±0,093	5,21±0,09	5,60±0,09
Фосфатидная кислота	4,01±0,13	4,34±0,071	3,05±0,07	4,27±0,08

Примечание: различия статистически значимы при: – ¹ – р < 0,05; ² – р < 0,01; ³ – р < 0,001 по сравнению с контролем.  

Так, на 16%, относительно контроля, увеличивалось содержание лизофосфатидилхолина и на 19% лизофосфатидилэтаноламина. Это определяет активацию фосфолипазы А₂. Одновременно наблюдалось достоверное снижение на 10% в содержании основного структурного компонента мембран – фосфатидилхолина. Известно, что при активации свободнорадикальных процессов в мембранах, в первую очередь, происходит окисление полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов, что и вызывает уменьшение их содержания. Следует отметить увеличение уровня сфингомиелина на 26%, что является защитной реакцией организма на повышение проницаемости мембран. Обращает на себя внимание снижение количества фосфатидилсерина на 20% при одновременном увеличении фосфатидилинозита на 13% и фосфатидной кислоты на 8%, что также подтверждает активацию фосфолипаз при стрессе.

При введении экстракта аралии или элеутерококка при стрессе (3 и 4 группы) нормализовался вес надпочечников и практически отсутствовали язвы слизистой желудка. Изменения исследуемых параметров в мембранах эритроцитов относительно контроля были менее выраженными, чем таковые во 2-й группе. При анализе физиологических характеристик эритроцитов крыс в 3-й группе отмечалось восстановление СДЭ и СОЭр до контрольных значений (6,60±0,08 мкм и 57,50±2,17 мкм³, соответственно), тогда как в 4-й группе СДЭ был выше контроля на 7% (6,91±0,04 мкм; р < 0,001), а СОЭр на 21% (65,99±2,46 мкм³, р<0,001). Активность СОД в 4-й группе превышала контрольный уровень на 20% (р < 0,05), МДА – на 21% (р < 0,05). То есть, введение элеутерококка не полностью сняло оксидативный стресс. Что касается осмотической резистентности эритроцитов, то при введении экстракта аралии границы устойчивости эритроцитов расширились: начало гемолиза происходило при 0,40±0,02% NaCI, а завершение при 0,30±0,01% NaCI (р<0,001). При введении элеутерококка начало гемолиза происходило при концентрации NaCI 0,47±0,01%, а завершение при 0,37±0,01%, то есть устойчивость эритроцитов была пониженной. Количество общих фосфолипидов в 3-й группе восстановилось до контрольных значений (62,46±1,31%), тогда как при введении элеутерококка содержание общих фосфолипидов было ниже контрольного уровня на 7% (р < 0,05). Аналогичная картина прослеживалась и в изменении уровня холестерина: при введении экстракта аралии его величина была на уровне контроля (24,37±1,32%), а при введении элеутерококка на 17% выше (28,00±1,07%). В результате коэффициент ХС/ФЛ в 3-й группе был 0,39±0,02, а в 4-й – 0,46±0,02. В фосфолипидном спектре мембран эритроцитов 3-й группы отсутствовали различия с контролем, тогда как в 4-й группе было выявлено достоверно сниженное содержание фосфатидилхолина (на 6%) и повышенное количество сфингомиелина (на 12%).

На основании выше изложенного следует, что влияние стресса вызывает напряжение системы антиоксидантной защиты и разбалансировку фосфолипидного состава мембран эритроцитов, что сопровождается изменением их размерных характеристик и, как следствие, функциональных свойств. Введение растительных экстрактов из осей соцветий Аралии маньчжурской и элеутерококка до- и в период стресс-воздействия способствовало восстановлению размерных характеристик эритроцитов и соотношения фосфолипидных фракций. Это обусловлено тем, что растительные полифенолы, входящие в состав экстрактов ингибируют фосфолипазы (Kropacova et al., 1998). Также растительные полифенолы являются «ловушками» свободных радикалов, что сдерживает процессы перекисного окисления липидов (Sanz et al., 2006). Молекулы полифенолов взаимодействуют с поверхностью мембран, и этим увеличивают прочность поверхностного слоя клеток, что препятствует язвообразованию (Афанасьева и др., 2007). Однако при сравнении эффектов действия экстракта из осей соцветий аралии и элеутерококка, наиболее близкими к контрольным значениям величины были в 3-й группе, тогда как в 4-й группе имелись достоверные отличия от контроля в размерах эритроцитов, в системе антиоксидантной защиты, в соотношении фосфолипидных фракций. В то же время, оба экстракта обладают мембранозащитными свойствами при действии стрессовых факторов. Применение препаратов к ежедневной диете позволит решить проблему профилактики стрессорных заболеваний.

Литература

1. Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р., Спирихин Л.В., Насибуллин Р.С. О механизме взаимодействия некоторых флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран //Хим.–фарм. журн. – 2007. – Т. 41, № 7. – С. 12–14.
2. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992. 148 с.
3. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фарм. комитета. – 1999. – № 2. – С. 9–12.
4. Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Лесникова Л.Н. и др. Использование биологически активной добавки, приготовленной на основе ягод калины, для предотвращения физиологических и биохимических изменений эритроцитов, возникающих при различных стрессах // Вопросы питания. – 2011. – Т. 80, № 1. – С. 64–69.
5. Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова В.И. Руководство по методам исследования параметров системы «Перекисное окисление липидов – антиоксидантная защита» в биологических жидкостях. – Владивосток: Изд–во Дальневосточного университета, 2003. 80 с.
6. Эндрю Б.Л. Экспериментальная физиология. М.: Мир, 1972. 324 с.
7. Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin–layer chromatography // J. Lipid. Res. – 1964. – Vol. 5, N 2. – P.270–272.
8. Folch J., Less M., Sloane–Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue // Biol. Chem. – 1957. – Vol. 226. – P. 497–509.
9. Kropacova, K. Misurova E, Hakova H. Protective and therapeutic effect of silymarin on the development of latent liver damage // Radiats. Biol. Radioecol. – 1998. – Vol. 38, N 3. – P. 411–415.
10. Sanz M. J., Ferrandiz M. L., Cejudo M. et al. Influence of a series of natural flavonoids on free–radical generating systems and oxidative stress // Xenobiotica. – 1994. – Vol. 24, N 7. – P. 689–699.
11. Singleton, V. L., R. Orthofer, et al. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin–Ciocalteu reagent // Oxidants and Antioxidants, Pt A. L. Packer. San Diego, Academic Press Inc., 1999. – Vol. 299. – P. 152–178.
12. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al. Free radicals and antioxidant in normal physiological functions and human disease // The Int. J. of Biochem. and Cell Biol. – 2007. – Vol.39. – P. 44–84.
13. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. A universal reagent for phospholid analysis // J. Chromatography. – 1975. – Vol. 114, N. 1. – P.129–141.