ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СОКА АРБУЗА НА ЛЮМИНЕСЦЕНТНУЮ РЕАКЦИЮ БАЗИДИОМИЦЕТА MYCENA GOMBAKENSIS

В последнее десятилетие был сделан значительный шаг к пониманию механизма грибной биолюминесценции. Было установлено, что грибное свечение обусловлено рядом последовательных ферментативных реакций и представляет собой замкнутый цикл. На начальном этапе кофейная кислота преобразуется в гиспидин, затем из гиспидина, в присутствии фермента гиспидин-3-гидроксилазы, образуется люциферин. Люциферин окисляется в присутствии люциферазы до оксилюциферина, который и излучает кванты света. Оксилюциферин может быть ферментативно преобразован в кофейную кислоту и цикл повторяется

При проведении исследовательских работ с использованием грибных люминесцентных систем in vivo и in vitro, в том числе оценивают эффекты различных веществ на интенсивность люминесценции. Интерес вызывают вещества стимуляторы, добавка которых приводит к увеличению интенсивности люминесцентного сигнала, но которые при этом не являются компонентами ферментной люминесцентной системы (фермент, субстрат, НАДФН). Экстракты из биомассы грибов

Ранее мы сообщали

В данной работе основное внимание уделяется влиянию арбузного сока (АС) на люминесценцию гриба M. gombakensis в экспериментах in vivo и in vitro. Как показали исследования, АС не содержит ни субстрат ферментной системы гриба M. gombakensis, ни НАДФН, однако, его добавка к мицелию и к выделенной ферментной системе приводит к увеличению люминесценции.

Арбузы, выращенные в Алтайском крае, Рубцовском районе, п. Березовка, приобретены в торговой сети города Красноярска. АС получали отжимом из мякоти плода с использованием ручного пресса с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 16000g на центрифуге Avanti J–E (Beckman–Coulter, США). Полученные образцы сока были лиофильно высушены (ЛС–500 (Россия)) и хранились до момента использования при -20°С. Лиофильная сушка позволяет осуществлять длительное хранение образцов без потери активности, а также при необходимости получить образцы с большей концентрацией. Перед проведением исследований образцы разводились в деионизованной воде Milli–Q system (Millipore, США).

В работе была использована культура обладающего свечением базидиомицета M. gombakensis (культура 2371) из Коллекции Института биофизики СО РАН. Жидкая картофельно-сахарозная среда (200 г/л картофеля, 20 г/л сахарозы) использовалась для наращивания мицелия гриба M. gombakensis. Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера, содержащих жидкую питательную среду при температуре 27°С с постоянным перемешиванием. Для получения пленочного мицелия культивирование осуществляли стационарно в чашках Петри, содержащих жидкую питательную среду, при температуре 27°С. Подробнее используемые методы культивирования описаны в работах

Полученные методом глубинного культивирования мицелиальные пеллеты в форме глобул отмывали деионизованной водой в течение суток и использовали для проведения экспериментов in vivo. В пробирку, содержащую 300 мкл воды помещали пеллету и прописывали базовый сигнал люминесценции. После чего аккуратно, без перемешивания вносили исследуемый образец АС и регистрировали изменения люминесцентного сигнала.

Холодные экстракты, выделенные из мицелия гриба M. gombakinsis и содержащие ферментную люминесцентную систему, использовали для оценки влияния АС в экспериментах in vitro. Ферментные системы получали по методике, описанной ранее

Регистрацию люминесцентных сигналов in vivo и in vitro систем проводили на люминометре Glomax 20/20 (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc., США), с режимом регистрации одно измерение в секунду.

Спектр биолюминесценции был получен с использованием спектрофлуориметра Cary Eclipse (Agilent Technologies, США). Измерения проводили следующим образом: в кварцевую кювету спектрофлуориметра, содержащую ферментную люминесцентную систему из гриба M. gombakensis и НАДФН, последовательно вносили экстракт P. squarrosa и регистрировали спектр биолюминесценции, а затем добавляли АС и вновь регистрировали спектр. 

Гель-документирующая система GelDoc XR Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) была использована для визуальной регистрации люминесцентного сигнала пеллет. Черно-белые изображения люминесцентных областей были преобразованы в цветные с использованием программного обеспечения.

3.1. Влияние АС на люминесцентные системы, выделенные из биомассы гриба M. gombakensis

В работе были использованы 2 вида ферментных систем, выделенных из мицелия гриба M. gombakensis, не имеющая эндогенного субстрата и содержащая эндогенный субстрат.

Отсутствие изменения в люминесцентном сигнале ферментной системы после внесения НАДФН свидетельствует о том, что система не содержит эндогенный субстрат. (Рис.1). Отсутствие изменений в регистрируемом сигнале ферментной системы, активированной НАДФН, после внесения АС означает, что сок не является субстратом люминесцентной системы (Рис.1).

Рисунок 1 - Интенсивность люминесценции ферментной системы из гриба M. gombakensis при добавке АС

Примечание: стрелками указаны моменты последовательного внесения НАДФН и АС

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.59.1

Увеличение люминесцентного сигнала ферментной системы in vitro при последовательном внесении НАДФН и экстракта из P. squarrosa свидетельствует, во-первых, о работоспособности ферментов данной системы, во-вторых, о наличии в экстракте P. squarrosa экзогенного субстрата, используемого ферментной системой из мицелия гриба M. gombakensis (Рис.2). Последующая добавка АС к ферментной системе дополнительно увеличивает люминесценцию (Рис.2). Следовательно, АС является стимулятором люминесцентной реакции.

Рисунок 2 - Стимуляция люминесценции ферментной системы без эндогенного субстрата, выделенной из гриба M. gombakensis после добавки АС

Примечание: стрелками указаны моменты последовательного внесения: НАДФН, экстракта из P. squarrosa и АС

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.59.2

При добавке НАДФН к ферментной люминесцентной системе, имеющей эндогенный субстрат, наблюдается увеличение интенсивности люминесцентного сигнала (Рис.3а). В то же время добавка АС к ферментной системе не приводит к изменению люминесцентного сигнала, что свидетельствует о том, что АС не содержит НАДФН (Рис.3б). Увеличение люминесцентного сигнала после добавки АС (Рис.3а) или НАДФН (Рис.3б) свидетельствует о том, что АС является стимулятором данной люминесцентной системы.

Рисунок 3 - Стимуляция люминесценции ферментной системы, содержащей эндогенный субстрат, выделенной из гриба M. gombakensis после добавки АС

Примечание: стрелками указаны моменты внесения: НАДФН и АС

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.59.3

3.2. Влияние сока арбуза на люминесценцию мицелия пеллет гриба M. gombakensis

АС является стимулятором люминесценции ферментных систем in vitro с экзогенным (Рис.2) и эндогенным субстратом (Рис.3а), а также стимулирует ферментную систему мицелия пеллет in vivo, содержащих эндогенный субстрат (Рис. 4,5).

Рисунок 4 - Изменение интенсивности люминесценции пеллеты M. gombakensis после добавления в воду АС

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.59.4

Использование гель-документирующей системы позволяет визуализировать развитие люминесцентного сигнала в ходе эксперимента (Рис.5). Первоначально регистрировали изображения внешнего вида пеллет находящихся в воде (Рис.5а) с низким уровнем исходного свечения (Рис.5б). После добавления АС в воду наблюдается постепенное увеличение интенсивности люминесцентного сигнала пеллет. Разница в интенсивности люминесценции до и после внесения АС видна уже через пять минут (Рис.5в). Максимальный люминесцентный сигнал достигается через 30 минут после обработки пеллет АС (Рис.5г). Полученный результат свидетельствует о том, что АС содержит стимулятор люминесценции мицелия пеллет гриба M. gombakensis. Интенсивность люминесценции является индивидуальной для каждой пеллеты и может быть локальной в пределах пеллеты.

Рисунок 5 - Динамика люминесценции пеллет мицелия культуры M. gombakensis: 

а – внешний вид пеллет; б – исходное свечение пеллет; в –свечение после добавления в воду АС через 5 минут; г – свечение после добавления АС через 30 минут

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.59.5

3.3. Спектр биолюминесценции

Измерение спектров биолюминесценции ферментативной люминесцентной реакции после добавления экстракта P. squarrosa и АС показало, что максимум биолюминесценции в обоих случаях составляет 520 нм (Рис.6).

Рисунок 6 - Спектры биолюминесценции ферментной системы после добавки экстракта P. squarrosa (экзогенный субстрат) и после последующей добавки АС (стимулятор)

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.59.6

В ходе работы была выявлена стимуляция АС люминесценции ферментной системы (in vitro) и мицелия пеллет (in vivo) базидиального гриба M. gombakensis. При этом показано, что АС не является ни субстратом выделенной ферментной системы, ни НАДФН. Механизм стимулирующего эффекта пока не ясен и требует дальнейших исследований.