УРОВЕНЬ ПЛАЗМЕННОГО ФРАКТАЛКИНА КАК АКТУАЛЬНЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР РАННЕЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ И СТЕПЕНИ ИХ ТЯЖЕСТИ
УРОВЕНЬ ПЛАЗМЕННОГО ФРАКТАЛКИНА КАК АКТУАЛЬНЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР РАННЕЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ И СТЕПЕНИ ИХ ТЯЖЕСТИ
Аннотация
Внебольничная пневмония (ВП) остается одной из ведущих патологий в группе болезней органов дыхания. В России летальность при ВП составляет 18 человек на 100 тысяч населения. В этих условиях важное диагностическое значение приобретают биохимические маркеров воспаления, к числу которых относятся цитокины, отвечающие за активацию, пролиферацию и хемотаксис различных клеток. К слабо изученным при внебольничной пневмонии цитокинам относится хемокин-CX3CL1 или фракталкин. Цель исследования – сравнить уровни фракталкин в плазме крови у больных с внебольничной пневмонией бактериальной и вирусной этиологии (COVID-19 и грипп). Материалы и методы. Обследовано 85 пациентов с ВП среднетяжелого течения (30 пациентов с ВП бактериальной этиологии, 30 – с COVID-19, ассоциированной ВП, 25 – с грипп-ассоциированной ВП), контролем служила плазма крови 25 доноров. Динамическое наблюдение за больными и их комплексное лабораторное и инструментально-функциональное обследование осуществляли в условиях ОИКБ (г. Астрахань). Исследование плазмы крови на концентрацию фракталкина проводили с помощью иммуноферментного набора для количественного определения фракталкина (СХ3СL1) в биологических жидкостях с применением тест-системы «RayBio® Human Fractalkine», фирмы «RayBiotech, Inc.» США. Результаты и их обсуждение. Уровни фракталкина в плазме крови у больных ВП на пике заболевания, имели достоверно более высокие значения, чем в группе контроля (в 9,4 раза у пациентов с бактериальной пневмонией, в 8,8 раза у пациентов с вирусной пневмонией, ассоциированной c COVID-19, и в 8,0 раза у пациентов c пневмонией, ассоциированной c вирусом гриппа). Учитывая разнонаправленное изменение содержания лейкоцитов в крови у пациентов с внебольничной пневмонией различной этиологии, нами предложен показатель, количество фракталкина на один лейкоцит. Определение медианы отношения ФКН/WBC у пациентов с ВП не только позволяет дифференцировать вирусную пневмонию от бактериальной, но и проводить диагностику между вирусной пневмонией, ассоциированной c COVID-19 и вирусом грипп. Заключение. В настоящей статье мы сравниваем плазменные уровни фракталкина с нормой и между группами пациентов с ВП бактериального и вирусного генеза (грипп и COVID-19). Анализ показателей фракталкина в пересчете на один лейкоцит выявил достоверные различия, позволяющие дифференцировать не только вирусную пневмонию от бактериальной, но и вирусную пневмонию, ассоциированную c COVID-19 от грипп-ассоциированной внебольничной пневмонии.
1. Введение
Внебольничная пневмония (ВП) остается одной из ведущих патологий в группе болезней органов дыхания. В России ежегодно внебольничной пневмонией заболевает 1,5 млн человек, из них две трети больных остается без правильного диагноза и, соответственно, лечения. В России летальность в этой категории пациентов составляет 18 человек на 100 тысяч населения , , . Актуальность изучения ВП обусловлена достаточно высокой распространенностью данной нозологии в популяции, эволюцией спектра возбудителей заболевания и их резистентностью к традиционным антибактериальным схемам, необходимостью алгоритмизации лечебно-диагностического подхода, а также индивидуализации медицинской помощи у каждого конкретного пациента с учетом оценки всех сопутствующих факторов (коморбидные состояния, чувствительность микрофлоры к медикаментозной терапии, тяжесть заболевания и наличие осложнений) , , , .
Основным проявлением ВП является инфекционное, экссудативное, реже межуточное воспаление, вызванное микроорганизмами различной этиологии и доминирующее во всей картине заболевания. Специфика инфекционного агента при ВП обеспечивает разнообразную клиническую симптоматики и рентгенологическую картину воспалительного процесса в нижних отделах дыхательных путей. К наиболее значимым по вирулентности и распространенности относятся пневмококки (Streptococcus pneumoniae), обнаруженные у 30-50% пациентов , .
В последние десятилетия имеет место снижение этиологической роли пневмококков, но отмечается увеличение числа пневмоний вирусной этиологии с тяжелым течением. Основной вклад в возрастание заболеваемости пневмониями вносят ОРВИ и грипп. По статистике Всемирной организации здравоохранения, в мире каждый год ОРВИ переносят до полумиллиарда человек, причем у 2 млн. человек на планете после гриппа и других ОРВИ развиваются различные осложнения, приводящие к летальному исходу пациентов. По данным ВОЗ показатели смертности от ОРВИ и гриппа в разных странах колеблются в диапазоне 0,01-0,2% , .
Важная роль в увеличение заболеваемости пневмониями связана со вспышкой новой вирусной инфекции COVID-19 , . У основной массы пациентов ВП на фоне COVID может протекать в легкой форме, что не исключает повторных заражений и развития различных постковидных осложнений , .
Для диагностики ВП существует обширный список специфических биомаркеров , . В развитии воспаления при пневмонии принимает участие каскад иммунологических реакций, значимую роль в запуске которых играет цитокины различного назначения, в том числе ответственные за процессы активации, пролиферации и хемотаксиса различных клеточных субпопуляций. Многие цитокины относятся к небольшим по размерам белкам, за способность вызывать направленный хемотаксис окружающих их клеток, получившим наименование «хемокины» , , .
Одним из членов семейства хемокинов является хемокин-CX3CL1 или фракталкин (ФКН), молекула которого состоит из внеклеточного N-концевого хемокинового домена, муцинподобного стержня, трансмембранного и внутриклеточного доменов , .
Впервые фракталкин (ФКН) был описан коллективом авторов в 1997 году , . В том же году другие ученые установили, что экспрессия ФКН на эндотелиальных клетках обеспечивается влиянием провоспалительных цитокинов . Биохимическая структура ФКН расшифрована и описана Locati и Murphy в 1999 году. Она представляет из себя домен, насаженный на муциноподобное сужение, связанное с плазматической мембраной через трансмембранный домен и цитоплазматический хвост .
Имеющиеся сведения о роли ФКН в патогенезе различных заболеваний позволяют рассматривать CX3CL1 и его рецептор CX3CR1 в качестве важных маркеров активации воспалительного процесса, связанного с хемотаксисом различных лейкоцитов (в первую очередь лимфоцитов и моноцитов) в зону бактериального воспаления. Они способствуют переносу лейкоцитов, макрофагов, фибробластов, клеток эпителия бронхов, гладкомышечных и других типов эффекторных клеток в очаг инфекции. Хемокины играют важную роль в противовирусной защите организма , . При этом большинство вирусов сами являются индукторами хемокинов.
Накоплены убедительные сведения о диагностической роли фракталкина при различной инфекциионной и неинфекционной патологии, в том числе при лечении внебольничной пневмонии различной этиологии , , .
Цель исследования – сравнить уровни фракталкина в плазме крови у больных с внебольничной пневмонией бактериальной и вирусной этиологии (COVID-19 и грипп) и оценить степень их тяжести.
2. Материалы и методы
У пациентов обоего пола, госпитализированных в областную инфекционную больницу г. Астрахани, с диагнозом «внебольничная пневмония» бактериальной и вирусной этиологии проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с дополнительной оценкой в плазме крови уровней фракталкина. Задействованные в исследовании пациенты поступили в стационар на 2-6 сутки заболевания. У всех 85 отобранных для исследования пациентов ретроспективно подтверждена внебольничная пневмония среднетяжелого течения. Были сформированы три группы больных с ВП: у 30 пациентов первой группы имело место бактериальная пневмония, у 30 пациентов второй группы имело место пневмония, ассоциированная с инфекцией вирусом COVID-19 (госпитализированы с диагнозом «COVID-19, вирус идентифицирован»), у 25 пациентов третьей группы имело место пневмония, ассоциированная с вирусом гриппа (Из них 52,0% больных были инфицированы вирусом гриппа А/H1N1, 48,0% – вирусом гриппа В). Возраст обследованных пациентов с ВП колебался от 20 до 59 лет (средний возраст – 41,2±1,7 года, медиана возраста 53,3 [44; 53]). Лица контрольной группы были сопоставимы по возрасту и полу с обследованными пациентами с ВП. От всех пациентов получено добровольное согласие на участие в исследовании. Для получения контрольных табличных значений использовали плазму 25 доноров крови. Критерии включения пациентов в исследование: наличие кашля с мокротой, лихорадки, характерной аускультативной картины в легких, наличие, подтвержденных рентгенологическим исследованием, инфильтратов в легочной ткани. Критерии исключения пациентов из исследования: наличие анамнеза онкологического заболевания, иммунодефицитных состояний, активного туберкулеза, а также пациенты, получавшие антимикробные химиопрепараты в предшествующие три месяца; пациенты, вакцинированные от пневмококка, беременные. Динамическое наблюдение включало стандартные при ВП клинические, инструментальные и лабораторные методы обследования. Для бактериологического исследования выполнялся посев мокроты, а для вирусологического исследование брался мазок из полости носа и ротоглотки для анализа методом полимеразной цепной реакции обратной транскрипции (ПЦР). Кровь для исследования на содержание фракталкина(ФКН) забирали в утренние часы из локтевой вены в охлажденные силиконизированные пробирки объемом 5 мл, содержащие комплексон К3. Образцы замораживались и доставлялись в специальном холодильнике в Институт по изучению лепры, где хранились при t = -70ºС до проведения анализа. Определение уровней ФКН в образцах плазмы осуществлялось с помощью иммуноферментного набора для количественного определения фракталкина (СХ3СL1) в биологических жидкостях с применением тест-системы «RayBio® Human Fractalkine», фирмы «RayBiotech, Inc.», США. Собранные цифровые данные обработаны программой STATISTICA 12.0 и представлены в таблице медианой, верхним и нижним квартилем. Для выявления статистических различий между исследуемыми группами применяли непараметрический критерий Манна-Уитни с уровнем значимости 0,05.
3. Основные результаты
У всех 30 пациентов первой группы с бактериальной пневмонией в остром периоде наблюдался продуктивный кашель, что позволило на 10- день заболевания выполнить у всех больных посев мокроты. У всех больных установлен бактериальный агент пневмонии: у 21 пациента высевался St. pneumoniae, у 3 пациентов – St. agalaktika, у 2 пациентов микст – St. pneumoniae + St. aureus и у 4 пациентов – микст St. pneumoniae + Ps. aerugnosa.
У всех 30 пациентов первой группы с бактериальной пневмонией наблюдался лейкоцитоз, в отличие от 30 пациентов второй группы с пневмонии, ассоциированной с COVID-19 вирусной инфекцией, сочетающейся с лейкопенией или нормальным содержанием лейкоцитов в крови.
Следует отметить, что у всех 25 пациентов третьей группы с гриппозной пневмонией средне-тяжелого течения, на самом деле ВП имела смешанную вирусно-бактериальную этиологию, так как у всех пациентов этой группы выявлен рост какой-либо из вышеперечисленных бактерий. Среди 25 пациентов с ВП, ассоциированной c вирусом гриппа, у 56,0% больных выявлен вирус гриппа А/H1N1, у остальных 44,0% пациентов выявлен вирус гриппа В.
Учитывая происхождение фракталкина и его связь уровнем лейкоцитов, в таблицу параллельно с ФКН включены данные о медиане и межмкартильном размахе уровней лейкоцитов и СОЭ в крови пациентов с ВП (таблица).
Таблица 1 - Уровни лейкоцитов, СОЭ и плазменного фракталкина в крови у пациентов с внебольничной бактериальной и вирусной пневмонией
Группа | n | Лейкоциты | СОЭ | Фракталкин | ||||||
× 109 клеток/л | % | p | мм/час | % | p | мкг/мл | % | p | ||
Контроль (доноры) | 25 | 5,47±1,11 5,44 [4,94; 5,85] | 100 | - | 2,9±0,50 2,0 [1,0; 4,0] | 100 | - | 0,33±0,009 0,32 [0,30; 0,35] | 100 | - |
Пациенты с бактериальной пневмонией | 30 | 11,23±0,35 10,82 [10,19; 12,32] | 205 | <0,001* | 14,6±1,49 15,5 [8,5; 17,8] | 503 | <0,001* | 3,02±0,211 3,02 [2,14; 3,63] | 915 | <0,001* |
Пациенты с вирусной пневмонией, ассоциированной c COVID-19 | 30 | 4,73±0,14 4,57 [4,07; 5,26] | 86 | <0,001* | 29,6±1,32 28,5 [25,0; 33,5] | 1021 | <0,001* | 2,75±0,143 2,81 [2,06; 3,25] | 833 | <0,001* |
Пациенты с пневмонией, ассоциированной c вирусом гриппа | 25 | 6,52±0,18 6,31 [5,85; 7,08] | 119 | <0,001* | 15,3±1,64 17,0 [8,0; 20,0] | 528 | <0,001* | 2,59±0,168 2,56 [1,90; 3,11] | 785 | <0,001* |
Все пациенты с внебольничной пневмонией | 85 | 7,55±0,34 6,85 [5,14; 10,23] | 138 | <0,001* | 20,1±1,14 19,0 [13,0; 28,0] | 693 | <0,001* | 2,80±0,103 2,78 [2,03; 3,33] 848% | 848 | <0,001* |
Достоверность различий между группами пациентов (p1, p2, p3) | р1-2<0,001* р1-3<0,001* р2-3<0,001* | р1-2<0,001* р1-3=0,771 р2-3<0,001* | р1-2=0,296 р1-3=0,110 р2-3=0,447 | |||||||
Примечание: * COVID-19 и грипп
Медианы концентрации ФКН в плазме крови у больных ВП в разгар заболевания, всегда статистически достоверно превосходят значения медиана концентрации ФКН у доноров (например, при бактериальной пневмонии в 9,4 раза, при вирусной пневмонии, ассоциированной c COVID-19 в 8,8 раза, и при вирусной пневмонии, ассоциированной с гриппом в 8,0 раз). Значения медианы ФКН по всем пациентам с внебольничной пневмонией отличалось от значения медианы концентрации ФКН в плазме крови доноров в 8,7 раза (таблица).
Для сравнения медианы количества лейкоцитов в крови у больных ВП в разгар заболевания, статистически достоверно превосходят значения медиана концентрации лейкоцитов в крови у доноров (например, при бактериальной пневмонии в 2,0 раза, и при вирусной пневмонии, ассоциированной с гриппом в 1,2 раза). Что касается пациентов с вирусной пневмонией, ассоциированной c COVID-19, то медианы количества лейкоцитов крови в этой группы пациентов имели достоверно в 1,2 раза более низкие значения, по сравнению со значениями медианы количества лейкоцитов доноров. Значения медианы количества лейкоцитов по всем пациентам с внебольничной пневмонией, было выше значений медианы контрольной группы в 1,3 раза (таблица).
А значения медианы СОЭ в крови у больных ВП в разгар заболевания, всегда статистически достоверно превосходят значения медиана СОЭ у доноров (например, при бактериальной пневмонии в 7,8 раза, при вирусной пневмонии, ассоциированной c COVID-19 в 14,3 раза, и при вирусной пневмонии, ассоциированной с гриппом в 8,5 раза). Значения медианы СОЭ по всем пациентам с внебольничной пневмонией отличалось от значения медианы СОЭ в крови доноров в 9,4 раза (таблица).
Все полученные данные сравнения медиан лейкоцитов (WBC), СОЭ и ФКН с контрольной группой статистически высокодостоверны (р<0,001).
При попарном сравнении медиан уровней плазменного фракталкина в паре бактериальная и COVID-вирусная пневмонии (р1), в паре бактериальная и грипп-вирусная пневмонии (р2), в паре COVID-вирусная пневмония и грипп-вирусная пневмония (р3), статистически достоверных различий не установлено ни в каком из трех сравнений (таблица).
При попарном сравнении медиан уровней лейкоцитов в паре бактериальная и COVID-вирусная пневмонии (р1), в паре бактериальная и грипп-вирусная пневмонии (р2), в паре COVID-вирусная пневмония и грипп-вирусная пневмония (р3), статистически значимое различие установлено во всех трех парах сравнений (таблица).
При попарном сравнении медиан СОЭ статистически значимое различие установлено в паре бактериальная и COVID-вирусная пневмонии (р1) и в паре COVID-вирусная пневмония и грипп-вирусная пневмония (р3). А в паре бактериальная и грипп-вирусная пневмонии (р2) различие статистически не значимы (таблица).
4. Обсуждение
Анализ литературных данных, посвященных изучению плазменного фракталкина при внебольничной пневмонии, свидетельствует о том, что уровень фракталкина у больных с тяжелой формой внебольничной пневмонии всегда достоверно выше (р=0,001), чем в группе со среднетяжелой формой заболевания. Этот факт указывает на тесную взаимосвязь между тяжестью заболевания и уровнем плазменного фракталкина , , . Кроме того, из данных литературы известен параллелизм между нарастание медианы ФКН с уровнем лейкоцитов в крови , , .
В некоторых работах не только указывается на связь плазменных уровней фракталкина с клиническими проявлениями внебольничной пневмонии, но также на связь концентрации ФКН с показателями спирографии, сатурацией , , .
При сопоставлении уровней плазменного фракталкина у пациентов с бактериальной и вирусной пневмонией нами установлено его увеличение относительно контрольной группы доновов в 8-9 раз. Уровни СОЭ при бактериальной и вирусной пневмонии также многократно превышают норму, что согласуется с общепринятыми сведениями , , .
При этом медиана СОЭ при COVID-19 ассоциированной пневмонии, повышен в 14,3 раза и статистически достоверно отличается от бактериальной и вирусной пневмонии. Учитывая, что при коронавирусной инфекции, в отличие от бактериальной и грипп-вирусной пневмонии, наблюдается выраженная лейкопения, представляло интерес найти способ стандартизации полученных в статье результатов.
Нами предложен технический прием, позволяющий по содержанию ФКН в лейкоците не только дифференцировать вирусную пневмонию от бактериальной, но и проводить дифдиагностику между вирусной пневмонией, ассоциированной c COVID-19 и пневмонией, ассоциированной c вирусом гриппа.
Чтобы стандартизировать разнонаправленные тенденции медиан лейкоцитов, мы ввели новый показатель, производный от фракталкина и уровня лейкоцитов – количество фракталкина на один лейкоцит (ФКН/WBC измеряемое в пкг/клетка).
Например, в норме у доноров эта величина составляет 0,59*10-4 пкг/кл, при бактериальной ВП эта величина составляет 2,8*10-4 пкг/кл, при COVID вирусной ВП эта величина составляет 6,1*10-4 пкг/кл, при грипп-вирусной ВП эта величина составляет 4,1*10-4 пкг/кл.
Отношение ФКН/WBC у больных внебольничной пневмонией имели достоверно более высокие значения, по сравнению со значениями ФКН/WBC группе доноров (например, при бактериальной пневмонии в 4,7 раза, при вирусной пневмонии, ассоциированной c COVID-19 в 10,3 раза, и при вирусной пневмонии, ассоциированной с гриппом в 6,9 раза).
Таким образом, определение медианы отношения ФКН/WBCу пациентов с ВП не только позволяет дифференцировать вирусную пневмонию от бактериальной, но и проводить дифдиагностику между вирусной пневмонией, ассоциированной cCOVID-19 и вирусом гриппа . А исследование фракталкина и отношения ФКН/WBC у пациентов с ВП представляется перспективным для разработки новых подходов к диагностике и раннему распознаванию формирующихся осложнений, что необходимо для проведения эффективной терапии внебольничной пневмонии.
5. Заключение
В настоящей статье мы сравниваем плазменные уровни фракталкина с нормой и между группами пациентов с ВП бактериального и вирусного генеза (грипп и COVID-19). Для получения объективных данных у этих же пациентов параллельно с фракталкином исследовали уровни лейкоцитов и СОЭ. Учитывая, что при коронавирусной инфекции, в отличие от бактериальной и грипп-вирусной пневмонии, наблюдается выраженная лейкопения, представляло интерес найти способ стандартизации полученных в статье результатов. Отношение ФКН/WBC позволяет сравнивать группы пациентов с ВП. Анализ показателей фракталкина в пересчете на один лейкоцит выявил достоверные различия, позволяющие дифференцировать не только вирусную пневмонию от бактериальной, но и вирусную пневмонию, ассоциированную c COVID-19 от грипп-ассоциированной внебольничной пневмонии. Полученные результаты исследования расширяют как возможности диагностики, так и прогнозирования степени тяжести внебольничной пневмонии, что необходимо для проведения эффективной терапии данной патологии.