Методология анализа микроэлементного состава растений на основе иерархической кластеризации

Микроэлементы, являясь простетическими группами ферментов, компонентами электрон-транспортных цепей и активными центрами фотосинтезирующих молекул, играют ключевую роль в жизнедеятельности растений. Они участвуют в регуляции ферментативных процессов, формировании активных метаболитов — биологически активных соединений (БАС), а также в обеспечении роста, развития и адаптации растений к воздействию факторов окружающей среды

Микроэлементный состав всё чаще включается в комплексную характеристику лекарственного растительного сырья (ЛРС)

Наряду с этим микроэлементы являются одним из факторов, определяющих токсикологическую безопасность ЛРС. Ряд элементов при превышении допустимых концентраций способен вызывать хронические интоксикации, повреждение органов и систем, а при длительном поступлении — канцерогенные эффекты

Несмотря на накопление значительного массива экспериментальных данных, интерпретация результатов микроэлементного анализа до настоящего времени остаётся неоднородной и часто опирается на упрощённые или концептуально устаревшие подходы.

Целью настоящей работы является критический анализ существующих методов интерпретации микроэлементного состава растений и обоснование применения иерархического кластерного анализа как системного метода, адекватного для решения задач фармакогнозии.

В настоящее время можно выделить несколько подходов к анализу результатов элементного анализа лекарственных растений. Одним из наиболее распространённых подходов является интерпретация лекарственных растений как концентраторов отдельных микроэлементов. Подобный подход широко представлен в фармакогностической литературе, однако он вступает в противоречие с современными представлениями о физиологии минерального питания растений

Многочисленные исследования показывают, что микроэлементный состав растений характеризуется выраженной онтогенетической изменчивостью

Кроме того, сама идея пассивного накопления микроэлементов противоречит данным физиологии растений, согласно которым поступление, транспорт и внутриклеточное распределение элементов находятся под жёстким контролем регуляторных механизмов и не сводятся к простой концентрации элементов из почвы

Другим широко используемым подходом является ранжирование микроэлементов по их содержанию. Экспериментальные данные при этом представляются в виде рядов элементов, упорядоченных по возрастанию или убыванию содержания

Информативность ранжирования элементов крайне ограничена, поскольку оно не отражает многомерную организацию элементного профиля и не позволяет выявлять закономерности, связанные с биологической спецификой объекта исследования. Упорядочивание элементов по величине концентрации не даёт возможности количественно сравнивать микроэлементные профили различных растений или партий сырья и практически неприменимо для задач идентификации и стандартизации ЛРС.

К этой же группе условно относятся коэффициенты биологического накопления, рассчитываемые как отношение содержания элемента в растении к его концентрации в почве

Третий подход к интерпретации микроэлементного состава растений основан на применении корреляционного анализа, при котором рассчитываются зависимости между концентрациями отдельных микроэлементов либо между микроэлементными профилями различных объектов. Корреляционный анализ широко используется для поиска статистических взаимосвязей между параметрами

С математической точки зрения коэффициент корреляции представляет собой нормированную ковариацию двух случайных величин и отражает исключительно линейный характер их взаимосвязи. При этом корреляционный анализ не учитывает нелинейные, пороговые и компенсаторные эффекты, характерные для биологических систем, в том числе для процессов минерального питания и микроэлементного гомеостаза растений

Дополнительным ограничением является экспоненциальный рост числа парных сравнений при увеличении числа анализируемых элементов. При анализе микроэлементного состава, включающего десятки элементов, число корреляционных пар исчисляется сотнями, что резко снижает статистическую надёжность выводов и увеличивает вероятность ложноположительных результатов.

Корректное применение корреляционного анализа предполагает возможность управляемого изменения одной из переменных при фиксированных значениях остальных факторов. В случае исследования микроэлементного состава растений, произрастающих в природных условиях, данное требование не выполняется, поскольку элементный профиль формируется под воздействием множества одновременно действующих и взаимосвязанных факторов

Часто корреляционный анализ дополняется визуализацией данных в виде линейных, радиальных или лепестковых диаграмм, построенных в координатах «концентрация элемента — его порядковый номер»

Широко применяемое логарифмирование концентраций микроэлементов, направленное на уменьшение диапазона значений, не устраняет фундаментальных методологических ограничений анализа. Как показано в работах по хемометрике и многомерной классификации, нелинейные преобразования, включая логарифмирование, изменяют геометрию пространства признаков и могут искажать относительный вклад переменных при расчёте расстояний и формировании кластерной структуры данных

Наиболее адекватным способом анализа многомерных данных по микроэлементному составу растений является системный подход с использованием иерархического кластерного анализа

Микроэлементный состав растения представляет собой совокупность количественных показателей — концентраций отдельных элементов. Каждая концентрация является непрерывной переменной и в этой связи микроэлементный профиль растения может быть представлен в виде вектора в n-мерном пространстве признаков

где xij — концентрация j-го микроэлемента в i-м образце (растительном объекте).

Такое векторное представление является общепринятым в многомерной статистике и не требует априорных предположений о функциональных связях между отдельными компонентами вектора, рассматривая объект как точку в пространстве признаков

Микроэлементный состав растений характеризуется широким диапазоном концентраций: от макро- и микроэлементов до ультрамикроэлементов, различающихся на несколько порядков величины. Использование исходных значений концентраций допустимо лишь в случаях, когда диапазоны значений элементов сопоставимы или когда доминирование отдельных элементов является биологически значимым признаком

В этой связи нормирование данных является принципиально важным этапом кластерного анализа, поскольку выбор способа масштабирования непосредственно определяет геометрию пространства признаков и, как следствие, структуру формируемых кластеров.

В отличие от нелинейных преобразований, таких как логарифмирование, линейные преобразования не искажают геометрию пространства признаков и не нарушают интерпретируемость расстояний

где μj и σj — среднее значение и стандартное отклонение j-го элемента.

Z-нормирование приводит все координаты пространства признаков к сопоставимому масштабу и устраняет доминирование элементов с большими абсолютными концентрациями, сохраняя при этом структуру относительной вариабельности микроэлементного профиля.

Для кластерного анализа микроэлементных профилей лекарственных растений наиболее обоснованным является использование нормированных концентраций микроэлементов в сочетании с евклидовой метрикой и методом Уорда

Евклидово расстояние обладает ясной геометрической интерпретацией как длина отрезка между двумя точками в n-мерном пространстве признаков. Вклад каждого микроэлемента в итоговое расстояние пропорционален квадрату разности его нормированных концентраций, что позволяет учитывать совокупный эффект различий по всем элементам, а не по отдельным парам

Иерархическая кластеризация осуществляется по агломеративному принципу, при котором каждый объект на начальном этапе рассматривается как отдельный кластер. Далее кластеры последовательно объединяются на основе некоего детерминированного критерия. Наиболее обоснованным для анализа микроэлементных профилей растений является метод Уорда, основанный на минимизации внутрикластерной дисперсии

где μС — центр кластера с M – числом объектов, включенных в кластер:

Центр кластера — это точка в n-мерном пространстве признаков, представляющая данный кластер как единое целое и минимизирующая суммарное расстояние (или дисперсию) до всех объектов кластера в выбранной метрике.

На каждом шаге алгоритма объединяются такие два кластера Ca и Cb, для которых при слиянии минимально увеличивается суммарная внутрикластерная дисперсия:

Метод Уорда, таким образом, формирует кластеры, максимально однородные по микроэлементному составу

Важным преимуществом кластерного подхода является возможность прямого учёта индивидуальной изменчивости микроэлементного состава. Внутрикластерная дисперсия отражает естественную вариабельность образцов одного типа (вид, партия сырья, условия заготовки), тогда как межкластерные расстояния характеризуют степень различия между группами.

Формально различие кластеров можно оценивать через соотношение межкластерной и внутрикластерной дисперсий:

где d — расстояние между кластерами, а WSSa и WSSb — внутрикластерные дисперсии. Значения R>1 свидетельствуют о том, что различие между кластерами превышает уровень индивидуальной изменчивости внутри них и имеет биологическую и фармакогностическую значимость.

Каждая координата центра кластера является средним значением, а следовательно обладает собственной статистической неопределённостью. Если погрешность определения концентрации j-го микроэлемента в отдельном образце равна σj то стандартная ошибка координаты центра кластера определяется как

Таким образом, с ростом объёма выборки центры кластеров становятся статистически устойчивыми интегральными характеристиками групп объектов, что позволяет использовать их для количественного сравнения микроэлементных профилей лекарственного растительного сырья в рамках евклидовой метрики и иерархической кластеризации

В рассматриваемых исследованиях микроэлементный профиль растения описывается в пространстве размерности n, при этом индивидуальная вариабельность концентраций отдельных элементов, обусловленная как биологическими факторами, так и аналитической погрешностью, составляет ε

При изотропной индивидуальной изменчивости, характерной для многокомпонентных микроэлементных профилей, вклад вариаций по отдельным координатам в относительном выражении не суммируется линейно с ростом размерности пространства. В результате характерный относительный масштаб внутрикластерной вариабельности определяется величиной порядка относительной изменчивости отдельных координат и не превышает величину ε — относительной изменчивости концентраций элементов. Аналогично и Евклидово расстояние между центрами двух кластеров также обладает относительной погрешностью порядка ε. Следовательно, если относительное расстояние между центрами кластеров превышает величину индивидуальной изменчивости, различие между ними выходит за пределы внутрикластерных флуктуаций и не может быть объяснено случайной вариабельностью микроэлементного состава.

В рамках предлагаемого методологического подхода различимость кластеров предлагается оценивать на основе соотношения межкластерных расстояний и уровня индивидуальной изменчивости микроэлементного состава. При относительной индивидуальной вариабельности концентраций микроэлементов порядка ε кластеры могут рассматриваться как различимые, если относительное евклидово расстояние между их центрами превышает указанную величину. Данный критерий носит методологический характер и направлен на согласование результатов кластерного анализа с биологически обусловленной вариабельностью микроэлементного профиля растений, что особенно важно для фармакогностических и фитохимических исследований.

Результаты иерархической кластеризации микроэлементных профилей визуализируются в виде дендрограмм, отражающих последовательность агломерации объектов и степень их сходства. Дендрограмма представляет собой графическое отображение процесса объединения кластеров в соответствии с выбранной метрикой расстояния и методом агломерации.

В фармакогностических исследованиях дендрограммы позволяют выявлять группы образцов с близкими микроэлементными профилями, которые могут интерпретироваться как отражение видовой специфичности, условий произрастания, особенностей заготовки или наличия примесей

Важно подчеркнуть, что дендрограмма не является самостоятельным методом анализа, а представляет собой способ визуализации результатов кластеризации. Интерпретация дендрограммы должна опираться на количественные характеристики кластеров — координаты их центров, внутрикластерные дисперсии и межкластерные расстояния. Попытки использовать форму дендрограммы без анализа этих параметров приводят к субъективным и методологически необоснованным выводам.

При использовании метода Уорда высота слияния кластеров на дендрограмме соответствует увеличению суммарной внутрикластерной дисперсии. Резкие скачки высоты агломерации указывают на объединение существенно различающихся кластеров и могут служить дополнительным ориентиром при выборе уровня отсечения дендрограммы. Однако окончательное решение о числе кластеров должно приниматься на основе соотношения межкластерных расстояний и уровня индивидуальной изменчивости, а не только визуальных критериев.

Применение иерархического кластерного анализа в фармакогностических исследованиях позволяет рассматривать микроэлементный состав лекарственного растительного сырья как интегральную характеристику, сформированную под воздействием совокупности биологических и экологических факторов. Такой подход принципиально отличается от анализа отдельных элементов и обеспечивает системную оценку объекта исследования.

Кластерный анализ позволяет решать ряд практических задач, включая идентификацию и подтверждение подлинности ЛРС, выявление примесей и атипичных образцов, а также оценку однородности партий ЛРС. Показано, что микроэлементные профили, обработанные методами иерархической кластеризации, обладают достаточной воспроизводимостью и чувствительностью для диагностики отклонений от эталонных характеристик.

Использование центров кластеров в качестве интегральных характеристик позволяет перейти от сравнения отдельных измерений к сопоставлению устойчивых статистических объектов. Это особенно важно в условиях выраженной индивидуальной изменчивости микроэлементного состава, характерной для растительного сырья. В отличие от одиночных значений концентраций, центры кластеров обладают меньшей статистической неопределённостью и более высокой интерпретируемостью.

Таким образом, иерархический кластерный анализ может рассматриваться как методологическая основа для разработки новых подходов к стандартизации ЛРС, дополняющих и расширяющих традиционные фармакопейные критерии качества.