Морфометрические показатели печени при диет-индуцированном ожирении

Учитывая прогрессирующий характер распространения алиментарного ожирения среди населения, к 2030 году ожидаемое количество лиц с избыточным весом и ожирением составит 3,3 млрд. человек

Многочисленные исследования, проведенные учеными in vivo и in vitro, демонстрируют достижение избыточного липидного обмена путем высокожировой диеты, что приводит к повышению уровня циркулирующих свободных жирных кислот и, следовательно, к снижению стимулированного инсулином поглощения глюкозы, а значит, к развитию нарушений углеводного обмена. По данным исследований, избыточное потребление липидов ассоциировано с инсулинорезистентностью как у грызунов, так и у людей

У здоровых людей постпрандиально происходит подавление продукции глюкозы печенью и одновременно увеличение ее поглощения, что объясняет поддержание концентрации глюкозы крови в пределах референсных значений после приема пищи, содержащей углеводы. У пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД 2), индексом резистентности (ИР) и ожирением отмечается увеличенная скорость окисления свободных жировых кислот (СЖК), которые являются стимуляторами эндогенной продукции глюкозы. Избыток СЖК увеличивает глюконеогенез в печени. Таким образом, отмечается четкая взаимосвязь между повышенной концентрацией СЖК в плазме крови, β-окислением СЖК и продукцией глюкозы в печени при ожирении и СД 2. Избыточная масса тела, ожирение, нарушения липидного обмена, ИР приводят к ускоренному поглощению СЖК гепатоцитами и последующему их окислению. В результате накапливается избыток ацетил-КоА, который через ряд биохимических реакций запускает глюконеогенез. Также повышенные концентрации СЖК ассоциируются с развитием и поддержанием ИР печени. При СД 2, кроме того, отмечается увеличенный уровень глюкагона в плазме

Жировая ткань в настоящее время все более активно рассматривается в качестве важного органа, обладающего пара-, ауто- и эндокринной активностью, в котором образуются метаболические гормоны, цитокины, в том числе провоспалительные, СЖК, глицерин, лептин, адипонектин, фактор некроза опухолей-α, висфатин, грелин, инсулиноподобный фактор роста-1, ангиотензиноген, ангиотензин II, ингибитор активатора плазминогена-1, трансформирующий фактор роста-β

В настоящее время недостаточно изучены структурно-функциональные особенности печени в условиях длительного поступления в организм избытка жиров различного происхождения при нарушениях в диете и несбалансированом питании. 

Цель работы – оценка морфометрических показателей печени крыс с диет-индуцированным ожирением.

Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г., №708н), а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.).

Опыты провели на 16 белых крысах-самцах Wistar половозрелого возраста массой 230-250 г. Животные получали воду в неограниченном количестве. 1 группа – интактная, 8 крыс. Животные получали стандартный суточный рацион – гранулированный комбикорм общей калорийностью 270 ккал/100г, где 20% белков, 70% углеводов, 10% жиров, и воду в свободном доступе

2 группа – опытная, 8 крыс. Животные в дополнение к стандартному суточному рациону получали высокожировое питание (пальмовое масло из расчета 30 г/кг) в течение 8 недель. Корм, насыщенный пальмовым маслом, готовили следующим образом: пальмовое масло заранее растапливали и смешивали со стандартным гранулированным кормом.

Незамедлительно после вывода животных из эксперимента кусочки наиболее крупной доли печени объемом 1см3 были помещены для фиксации в емкости с 10% забуференным формалином при комнатной температуре. По истечении 48 часов биоматериал был подвергнут стандартной пробоподготовке – процессу обезвоживания, обезжиривания и пропиткой парафином в гистопроцессоре МТР-120 (Medical, Germany), с последующей заливкой в парафиновые блоки по системе заливки парафином модульной Tissue-Tec-5 (Sacura) (Finetek, USA). Далее изготавливали срезы толщиной 4 мкм для методики окрашивания гематоксилином Джилла (ООО«ЭргоПродакшн», Россия) и эозином (Вектон, Россия). Срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также проводили ШИК-реакцию. Микропрепараты изучали под микроскопом «Ломо» с видеокамерой «DV1000». С помощью программы «McrAView 7.3.1.7» (ЛОМО-микросистемы, Россия) получали цифровые микрофотографии одинаковой площади, на которых производили общую и сравнительную оценки степени и распространенности структурных изменений при увеличениях микроскопа от х40 до х400, при необходимости с объективом х 100 с масляной иммерсией. Определяли следующие показатели: относительную площадь гепатоцитов, относительную площадь ядер и цитоплазмы гепатоцитов, ядерно-цитоплазматическое отношение, а также число гепатоцитов в поле зрения.

Для каждого массива данных было вычислено среднее значение (М), стандартная ошибка (m), стандартное среднеквадратичное отклонение s, дисперсия значений s2 и коэффициент вариации V. Расчеты проводились с помощью программы «Microsoft Excel 6.0». Также сравнение групп данных экспериментальных исследований производилось множественным непараметрическим методом по критерию Крускала-Уоллиса с апостериорным тестом Данна и поправкой Бонферрони в онлайн-ресурс Kruskal Wallis Test Calculator. Различия считались достоверными при p<0,05.

В процессе эксперимента в первые 14 суток достоверно значимых различий в массе тела крыс контрольной и интактной групп не было зарегистрировано. Однако к концу 21 суток появилась тенденция к незначительному ее возрастанию. Длительный восьминедельный прием в пищу дополнительно к суточному рациону избытка пальмового масла спровоцировал резкое возрастание массы тела крыс в динамике по сравнению со значениями массы тела животных интактной группы (табл.1). Достоверные статистически значимые различия в показателях массы крыс интактной и контрольной групп были установлены на поздних сроках наблюдения. Так, к концу 8-ой недели масса тела животных, употребляющих избыточное количество пальмового масла, на 18-20% превышала массу тела крыс интактной группы (431±12 г по сравнению с 366±13 г).

У всех животных интактной группы обнаружена типичная картина нормального микроскопического строения печени, что отражено на рис 1. В структуре паренхимы четко определяется дольковая структура в виде гексагональных областей, контурированных за счет более интенсивной окраски цитоплазмы периферических (перипортальных) гепатоцитов – темных, и портальных трактов. В центре этих областей расположены округлые безмышечные центральные вены различного диаметра и чаще пустые. Территория долек сформирована лабиринтообразно анастомозирующими трабекулами из гепатоцитов, между которыми расположены синусоидные капилляры, в некоторых участках содержащие слепки из эритроцитов, дискретно расположенные лейкоциты и не отграниченные от печеночных трабекул дополнительными тканевыми элементами.

Рисунок 1 - Печень крысы интактной группы

Примечание: шик-реакция

DOI:10.60797/IRJ.2025.152.46.2

Гепатоциты с четкими внешними контурами, эухроматиновыми ядрами, чаще содержащими одно, а у небольшого количества клеток два и даже 3 ядрышка – чаше у перипортальных с активным белковым синтезом. Цитоплазма перипортальных –темных, гепатоцитов более плотная, умеренно базофильная, у центролобулярных – светлых, с очагами просветления за счет дегликогенизации при гистологической обработке материала, на остальной территории с базофильными агрегатами, вероятнее гранулярной ЭПС, без иных заметных включений. 

Результаты гистологического исследования срезов печени крыс, находившихся на высокожировой диете на протяжении 8 недель показали, что у животных второй группы (рис 2-рис.4) выявлены значимые патогистологические изменения дистрофического характера во всех зонах долек, но с тенденцией к преобладанию в третьей – центролобулярной. В перипортальных гепатоцитах превалировала гидропическая дистрофия, очагами имелось мелкокапельное ожирение. В промежуточной зоне ожирение имело смешанный средне-крупнокапельный характер и ему сопутствовали небольшие преимущественно мононуклеарные воспалительные инфильтраты по типу микрогранулем. Центролобулярные зоны характеризовались выраженным средне-крупнокапельным ожирением.

Рисунок 2 - Печень крысы с диет-индуцированным ожирением

Примечание: шик-реакция

DOI:10.60797/IRJ.2025.152.46.3

Рисунок 3 - Печень крысы с диет-индуцированным ожирением

Примечание: шик-реакция

DOI:10.60797/IRJ.2025.152.46.4

Рисунок 4 - Печень крысы с диет-индуцированным ожирением

Примечание: шик-реакция

DOI:10.60797/IRJ.2025.152.46.5

Избыточное количество пальмового масла в пищевом рационе животных на протяжении двух месяцев отразилось и на морфометрических показателях печени. Результаты измерений и расчетов представлены в сводной таблице 2 и отображены на рисунке 5.

Рисунок 5 - Результаты морфометрического исследования печени с диет-индуцированным ожирением

DOI:10.60797/IRJ.2025.152.46.7

Множественное сравнение данных экспериментальных исследований морфометрических показателей печени исследуемых групп по критерию Крускала-Уоллиса представлены в табл. 3.

По результатам данных, приведенных в табл. 3, установлено, что апостериорный тест Данна с использованием поправки Бонферрони (0,0011) показал, что средние ранги следующих пар имеют достоверные различия (где p < 0,05): для площади ядер гепатоцитов, для размера ядер гепатоцитов, для цитоплазматического отношения, для площади гепатоцитов.

Лабораторные животные с диет-индуцированным ожирением характеризовались изменениями морфометрических показателей печени. Так, показатель площади ядер гепатоцитов на срезах печени крыс контрольной группы имеет достоверно значимые различия (p < 0,00000652) с аналогичным показателем у интактных крыс и превышает их на 50,44%. Также обнаружена тенденция к увеличению площади цитоплазмы гепатоцитов при избыточном хроническом потреблении в пищу пальмового масла. Достоверность различий по размеру гепатоцитов у крыс с диет-индуцированным ожирением в сравнении с интактными животными составила (p < 0,0002965), превышение составляет 9,62%. Ядерно-цитоплазматическое отношение гепатоцитов при изучении микропрепаратов печени крыс после двухмесячного пребывания на высокожировом рационе превышало достоверно (на p < 0,000003206) на 38,46% соответствующее значение у крыс интактной группы.

Суммируя полученные данные относительно морфологических изменений в печени крыс контрольной группы, можно прийти к заключению о том, что в ткани печени крыс с экзогенным воздействием, приводящим к алиментарному ожирению, во всех образцах нами были выявлены явления выраженной вакуольной, жировой дистрофии и некроза гепатоцитов. Относительно морфометрических изменений микроархитектоники печени, можно заключить, что наблюдаемые нами изменения на срезах данного органа детоксикации согласуются с мнением ряда авторов согласно преобразованиям, соответствующих гепатозу. Выраженные нарушения структуры печени с одновременным увеличением количества и размеров гепатоцитов можно расценивать, как компенсаторную реакцию, развивающуюся в ответ на повреждающий экзотоксический фактор (алиментарная нагрузка избытком пальмового масла).

В научной работе Бивалькевич Н.В. «Морфологические изменения ткани печени при экспериментальной дислипидемии» описан эксперимент на крысах с формированием дислипидемии. Формировали эксперимент введением гиперкалорийнной высокожировой диеты. Она включала в себя 19% топленого говяжьего сала и 2% холестерина, после 30, 90, 180 дней проводили биопсию печени. На 30 день исследования у экспериментальной группы было выявлено следующее: изменения балочной структуры печеночных долек, гепатоциты были расположены беспорядочны, они плотно прилегали друг к другу, тем самым сужали просветы синусоидных капилляров, большая часть из клеток печени были гипертрофированы, с измененной формой, сниженной базофилией и вакуализированной цитоплазмой. Помимо этих изменений, также присутствовали признаки деструкции ткани, некоторые клетки приобретали вид пустотелых структур с эктопично расположенным пикнотическим ядром

Через 90 дней у крыс формировался стеатогепатит, при котором наблюдался фокальные участки некробиоза с лимфомакрофагальной инфильтрацией. В препортальной и центральной зонах долек синусоидные капилляры были расширены, лимфатические сосуды имели крупные размеры, центральные вены полнокровные. Гепатоциты были гипертрофированы с мелкокапельной и крупнокапельной вакуализацией. Кариоплазма плотная с 1-2 ядрышками. Также диета привела к изменению архитектоники морфофункциональных единиц печени с деструктивными изменениями и некрозом. На 180 день были отмечены значительные изменения в печени: обширные участки некроза, мезенхимально-клеточная реакция, гепатоциты не образовывали трабекул, располагались беспорядочно, синусоиды резко сужены, портальные тракты расширены, желчные протоки подвержены деструкции. Сами же гепатоциты увеличены в размерах, цитоплазма мелкоячеистая просветленная, ядра, сморщенные и смещены к периферии. Очень выражено замещение ткани печени на соединительную ткань, формируется фиброз.

Таким образом, выявленные морфометрические изменения печени после пребывания лабораторных крыс на протяжении двух месяцев на высокожировом пищевом рационе приводили к увеличению на 12% среднего числа гепатоцитов в поле зрения, возрастанию на 9% числа двуядерных гепатоцитов относительно показателей в интактной группе. Кроме того, смоделированные нарушения приводили к увеличению среднего размера гепатоцитов почти на 10%, в большей степени за счет площади их цитоплазмы. Соответственно, происходило нарушение ядерно-цитоплазматического отношения, которое увеличилось на 38% по сравнению с показателем интактной группы. Эти изменения свидетельствуют о предпосылках к формированию жирового гепатоза.