ПСИХРОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ПОЧВ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

ПСИХРОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ПОЧВ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

Научная статья

Сидоренко М.Л.^1, *, Слепцова Н.А.², Немченко Ю.К.³

¹ ORCID: 0000-0003-2008-3029;

² ORCID: 0000-0002-4226-1984;

^{1, 2} ФНЦ Биоразнобразия наземной биоты восточной Азии ДВО РАН Владивосток, Россия;

³Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, Россия

* Корреспондирующий автор (sidrenko[at]biosoil.ru)

Аннотация

Из почв Дальневосточного региона России (Сахалин, Якутия, Еврейская автономная область, Амурская область, Магадан, о. Итуруп, Камчатка) выделены 70 психротрофных изолятов микроорганизмов. В результате скрининга выделенных изолятов на наличие ферментативной активности (амилазной, протеазной и липазной) установлено, что всеми тремя активностями  обладают три изолята, выделенные из почв о. Итуруп и Якутии. Две из трех активностей показали 16 изолятов. Таким образом, наиболее перспективными являются 21 изолят, которые были введены в коллекцию для дальнейшего изучения.

Ключевые слова: психротрофные микроорганизмы, почвы, Дальний восток, ферменты, амилаза, протеаза, липаза. 

PSYCHROTROPHIC MICROORGANISMS OF THE FAR EAST SOILS

Research article

Sidorenko M.L.^1, *, Sleptsova N.A.², Nemchenko Yu.K. ³

¹ ORCID: 0000-0003-2008-3029;

² ORCID: 0000-0002-4226-1984;

³ Federal Research Center for Biodiversity of Terrestrial Biota in Eastern Asia, FEB RAS, Vladivostok, Russia;

³ Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia

* Corresponding author (sidrenko[at]biosoil.ru)

Abstract

70 psychrotrophic isolates of microorganisms were isolated from the soils of the Far Eastern region of Russia (Sakhalin, Yakutia, the Jewish Autonomous Region, Amur Region, Magadan, Iturup Island, Kamchatka). It was established that three isolates taken from the soils of l. Iturup and Yakutia have all three activities as a result of the screening of these isolated isolates for the presence of enzymatic activity (amylase, protease, and lipase). Two of the three activities showed 16 isolates. Thus, 21 isolates, which were introduced into the collection for further study, are the most promising ones.

Keywords: psychrotrophic microorganisms, soils, Far East, enzymes, amylase, protease, lipase. 

Введение

Несмотря на жесткие условия среды, микроорганизмы колонизировали холодные места обитания на Земле. В зависимости от оптимальной температуры для роста, они могут быть психрофильными или психротолерантными (психротрофными). Психрофилы могут расти при низких температурах от -20 до 10°C и неспособны расти при температурах выше 15°C. Психротолерантные микроорганизмы, в свою очередь, имеют температурный оптимум роста от 20 до 25°C, но также сохраняют высокую метаболическую активность и способность к росту при температурах ниже 0°C [1]. Как правило, психротолерантных микроорганизмов находят в наземных экосистемах, а психрофильных – в морских [2].

Для поддержания метаболических процессов в холодных местах обитания, психрофилы используют ферменты, обладающие высокой удельной активностью при низких температурах. Такие ферменты обычно называются холодоактивными и являются  перспективным ресурсом для применения в биотехнологии и промышленности. Благодаря высокой каталитической активности при температурах ниже 25°C, они представляют собой превосходный биокатализатор, не требующий нагревания, что обеспечивает более высокое качество продукции, устойчивость и эффективность промышленных процессов. Ферменты не токсичны, биоразлагаемы, а их селективное действие и высокая каталитическая активность обеспечивает высокую степень безопасности, низкие энергозатраты и экологически чистое производство [3].

Помимо активности при низких температурах, интересна также их высокая термолабильность, которая обеспечивает возможность быстрой инактивации этих ферментов путем мягкой термической обработки, что представляет особый интерес в пищевой промышленности [4].

Цель данной работы – создание базовой коллекции микробных изолятов психрофильных и психротолерантных микроорганизмов из почвы, перспективных для дальнейшей разработки биотехнологических препаратов.

Материалы и методы

В ходе данной работы были исследованы 35 образцов почв, которые отбирали в период с сентября по декабрь 2018 года: по 3 образца из Сахалина, Якутии, ЕАО и Амурской области; по 5 образцов из Магадана и Итурупа; и 13 образцов с Камчатки из которых выделено 70 изолятов психрофильных и психротолерантных микроорганизмов (см. Таблицу 1).

 

Таблица 1 – районы исследования и изоляты микроорганизмов

Район отбора почвенных образцов (количество)	Изоляты (количество)
о. Сахалин (3)	Сах1, Сах2, Сах3, Сах4, Сах5 (5)
Якутия (3)	ЯВ13 ЯВ14 ЯП1 ЯП2 ЯУ1 ЯУ17 ЯУ3 ЯУ4 ЯУ6 ЯУ7 (10)
ЕАО (3)	Е1-2, Е1-4, Е2-1, Е2-2, Е3-1, Е3-2 (6)
Магадан (5)	М1-1, М1-2, М1-3, М1-4, М2-1, М2-2, М2-3, М3-2, М3-3, М3-4, М5-1 (11)
о. Итуруп (5)	И1-1, И2-1, И3-1, И3-2, И4-1, И4-2, И4-3, И5-1, И5-2, И5-3, И5-4, И5-5, И5-6, И5-7, И6-1 (15)
Камчатка (13)	1Г33ц, 2Г33ц, 3Т13ц, 4 Кам, 5 Кам, 6 Кам, КТ1, КТ10, КТ11, КТ12, КТ13, КТ2, КТ3, КТ4, КТ5, КТ6, КТ7, КТ8, КТ9 (19)
Амурская область (3)	Ам1, Ам2, Ам3, Ам4 (4)

 

Образцы почвы отбирали стерильными инструментами и помещали в стерильную посуду согласно ГОСТ 17.4.4.02-84 [5]. До начала работы образцы хранились в холодильнике при температуре от 4 до 5°С не более суток.

Для изоляции бактерий почвенную суспензию в отношении 1:10 (10 г почвы и 90 мл физ. раствора) диспергировали на шейкере ELMI Shaker S-3.09M (Германия) на 30 минут при 110 об/мин. Затем высевали на питательный агар методом Дригальского и инкубировали при 6°С в течение 7 дней.

Морфологию клеток исследовали в мазках, окрашенных по Граму с помощью микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 (Германия) с использованием объективов 40х и 100х.

Наиболее распространенные ферментативные активности (липазу [6], амилазу, протеазу [7]) проверяли на средах, с добавлением крахмала, 0,5% молока и Твин-80 соответственно, которые инкубировали при 4°С и 25°С в течение 1-7 дней.

Оптимальные температуры для роста устанавливали с помощью культивирования микроорганизмов в 100 мл питательного бульона при 6°С, 25°С и 37°С. Начальная концентрация микроорганизмов подсчитывалась с использованием камеры Горяева. Изменения концентрации определяли на фотоколориметре APEL AP-101. По полученным данным строились кривые роста.

Все цифровые данные, полученные в результате исследований, подвергали статистической обработке с использованием некоторых формул [8], а также компьютерных программ Statistic и Excel.

Результаты и обсуждения

В результате исследований 35 почвенных образцов было выделено 70 изолятов микроорганизмов, различным по своим морфологическим свойствам.

Все полученные в ходе работы изоляты были протестированы на ферментативную активность. Изоляты, выделенные из образцов почвы, собранных на о-ве Итуруп были более активны при 25С. Два изолята из ЕАО (Е1-2 и Е2-1) показали липолитическую активность при 6°С, тогда как при 25°С она не проявлялась. Якутские изоляты не обладали липазной активностью при 6°С, но она проявилась при 25°С. Изоляты из Магаданской области при 6С обладали только протеазной активностью, но при 25С проявились амилазная и липазная. Камчатские изоляты не были активны при 6С, но при 25С амилолитическую активность показали 6 изолятов (1Г33ц, 2Г33ц, 3Т13ц, 4 Кам, 5 Кам, 6 Кам), протеолитическую активность - 6 изолятов (2Г33ц, 3Т13ц, КТ10, КТ12, КТ13, КТ8) и 1 изолят обладал липолитической активностью (КТ8). Изоляты из почв Амурской и Сахалинской областей совсем не обладали амилазной активностью, а при 6°С не показали ни одной из трех активностей.

В целом, можно сделать вывод, что все полученные изоляты, независимо от района сбора, были более активны при 25С. При 6С наиболее активны были изоляты из Итурупа, Магадана и ЕАО.

Среди всех изолятов, проявляющих амилазную активность, можно выделить И4-1, И5-3, Е1-4 и ЯП2 как наиболее активные (с зоной гидролиза более 5 мм). По протеазной активности выделяются изоляты И3-2, И4-1 и И5-7.

Всеми тремя активностями обладают только три из исследованных изолятов – И4-1, И5-6 и ЯП2. Две из трех активностей показали 16 изолятов (И1-1, И5-3, Е1-2, Е2-1, Е2-2, Е3-2, ЯУ3, ЯУ4, М2-1, М3-2, 2Г33ц, 3Т13ц, Сах1, Сах2, Сах3, Ам1).

При проверке температурных оптимумов некоторых наиболее перспективных изолятов, было установлено, что все они лучше растут при 25°С, но при этом также могут расти при 6°С, то есть являются псифротрофами (рисунок 1).

Рис. 1 – Кривые роста микроорганизмов, изолированных из образцов почв Амурской области (Ам-1), ЕАО (Е2-1) и Итурупа (И4-1, И 5-6), при различных температурах

  Заключение

Таким образом, выявлено микробное разнообразие образцов почвы из семи регионов Дальнего Востока: Якутии, Сахалина, ЕАО, Амурской области, Магадана, Итурупа и Камчатки. В результате скрининга выделенных изолятов на наличие ферментативной активности было установлено, что всеми тремя активностями (амилазной, протеазной и липазной) обладают три изолята – И4-1, И5-6 и ЯП2. Две из трех активностей показали 16 изолятов (И1-1, И5-3, Е1-2, Е2-1, Е2-2, Е3-2, ЯУ3, ЯУ4, М2-1, М3-2, 2Г33ц, 3Т13ц, Сах1, Сах2, Сах3, Ам1). Температурные оптимумы всех исследованных изолятов находятся в пределах 25С, но также возможен рост при 6С. Таким образом, их можно отнести к психротрофным микроорганизмам. Наиболее перспективными являются 21 изолят, которые были введены в коллекцию для дальнейшего изучения. 

Финансирование Статья подготовлена по результатам работы, выполненной при финансовой поддержке Президиума ДВО РАН (проект 18-МНТ-010).	Funding The article was prepared based on the results of work carried out with the financial support of the Presidium of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences (project 18-МНТ-010).
Благодарности Выражаем благодарность за помощь в отборе образцов почв в Магаданской области – д.б.н., главному научному сотруднику, Макарченко Е.А. и на о. Итуруп – к.б.н., ведущему научному сотруднику ФНЦ Биразнообразия ДВО РАН, Булах Е.М.	Acknowledgement We are grateful for the help in the selection of soil samples in the Magadan Region   - PhD in Biology, Chief Researcher FSC East Asia Terrestrial Biodiversity FEB RAS, E.A. Makarchenko and on Iturup Island – PhD in Biology, Leading Researcher FSC East Asia Terrestrial Biodiversity FEB RAS, E.M. Bulakh
Конфликт интересов Не указан.	Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Pikuta E.V. Microbial extremophiles at the limits of life/ E.V. Pikuta, R.B. Hoover, J. Tang // Crit Rev Microbiol. - 2007. - №33(3). - p. 183-209.
2. Yumoto I. Cold-Adapted Microorganisms/ I. Yumoto // Norfolk, UK: Horizon Scientific Press. - 2013. - p. 244.
3. Wang S.Y. A novel cold-active xylanase from the cellulolytic myxobacterium Sorangium cellulosum So9733-1: gene cloning, expression, and enzymatic characterization / S.Y. Wang, W. Hu, X.Y. Lin, Z.H. Wu, Y.Z. Li // Appl Microbiol Biotechnol. - 2012. - №93(4). - p. 1503-12.
4. Margesin R. Biotechnological applications of psychrophiles/ R. Margesin, Feller // Environ Technol. - 2010. - №31(8-9). - p. 835-44.
5. ГОСТ 17.4.4.02-84 Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа. – Введ. 1986-01-01. – М.: Изд-востандартов, 1985. – 8с.
6. Booth C. Introduction to general methods. / C. Booth // Methods Microbiol. Academic Press, New York, 1978. – pp 57–91.
7. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus / F.G. Priest // Bacteriol Review. – 1977. – V.41. – pp. 711–753.
8. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. - 350 с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Pikuta E.V. Microbial extremophiles at the limits of life/ E.V. Pikuta, R.B. Hoover, J. Tang // Crit Rev Microbiol. - 2007. - №33(3). - p. 183-209.
2. Yumoto I. Cold-Adapted Microorganisms/ I. Yumoto // Norfolk, UK: Horizon Scientific Press. - 2013. - p. 244.
3. Wang S.Y. A novel cold-active xylanase from the cellulolytic myxobacterium Sorangium cellulosum So9733-1: gene cloning, expression, and enzymatic characterization / S.Y. Wang, W. Hu, X.Y. Lin, Z.H. Wu, Y.Z. Li // Appl Microbiol Biotechnol. - 2012. - №93(4). - p. 1503-12.
4. Margesin R. Biotechnological applications of psychrophiles/ R. Margesin, Feller // Environ Technol. - 2010. - №31(8-9). - p. 835-44.
5. GOST 17.4.4.02-84 Ohrana prirody. Pochvy. Metody otbora i podgotovki prob dlya himicheskogo, bakteriologicheskogo, gel'mintologicheskogo analiza [Protection of Nature. The soil. Sampling and sample preparation methods for chemical, bacteriological, helminthological analysis]. – Vved. 1986-01-01. – : publishing house standartov, 1985. – 8p. [in Russian]
6. Booth C. Introduction to general methods. / C. Booth // Methods Microbiol. Academic Press, New York, 1978. – pp 57–91.
7. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus / F.G. Priest // Bacteriol Review. – 1977. – V.41. – pp. 711–753.
8. Lakin G.F. Biometriya [Biometry] / G.F. - M.: Vysshaya shkola, 1990. - 350 p. [in Russian]