ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ RAPD-ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР-АНАЛИЗА ПОПУЛЯЦИЙ ЭНТОМОФАГА HABROBRACON HEBETOR SAY

ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ RAPD-ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР-АНАЛИЗА ПОПУЛЯЦИЙ ЭНТОМОФАГА HABROBRACON HEBETOR SAY

Научная статья

Беседина Е.Н.^1, *, Агасьева И.С.², Падалка С.Д.³, Исмаилов В.Я.⁴

¹ ORCID: 0000-0002-9976-5614;

² ORCID: 0000-0002-1216-1106;

³ ORCID: 0000-0001-8478-5332;

⁴ ORCID: 0000-0002-6713-0059;

^{1, 2, 3, 4} Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений, Краснодар, Россия

* Корреспондирующий автор (katrina7283[at]yandex.ru)

Аннотация

Проведен ПЦР-анализ краснодарской популяции высокоэффективного энтомофага чешуекрылых вредителей кукурузы, сои, плодовых и овощных культур Habrobracon hebetor Say. по RAPD-маркерам. Выявлены RAPD-праймеры (GT09, OPA10, OPB01, OPB04, OPC01, OPC05 и UBC519), пригодные для оценки ДНК-полиморфизма популяций габробракона, обладающие высокой специфичностью и информативностью. Данные праймеры могут быть использованы для внутривидовых сравнений и оценки генетического разнообразия изучаемого вида паразитического насекомого.

Ключевые слова: энтомофаг, Habrobracon hebetor Say., RAPD-ПЦР, высокоспецифические праймеры, ДНК-полиморфизм, популяция.

HIGH-SPECIFIC RAPD PRIMERS FOR PCR ANALYSIS OF HABROBRACON HEBETOR SAY ENTOMOPHAGE POPULATIONS

Research article

Besedina E.N.^1, *, Agasyeva I.S.², Padalka S.D.³, Ismailov V.Ya.⁴

¹ ORCID: 0000-0002-9976-5614;

² ORCID: 0000-0002-1216-1106;

³ ORCID: 0000-0001-8478-5332;

⁴ ORCID: 0000-0002-6713-0059;

^{1, 2, 3, 4} All-Russian Research Institute of Biological Plant Protection, Krasnodar, Russia

* Corresponding author (katrina7283[at]yandex.ru)

Abstract

The article contains PCR analysis of the Krasnodar population of the highly efficient entomophage Habrobracon hebetor Say of Lepidopteran pests of maize, soybean, fruit and vegetable crops conducted by RAPD primers (GT09, OPA10, OPB01, OPB04, OPC01, OPC05, and UBC519). RAPD primers suitable for evaluating DNA polymorphism of Habrobracon populations with high specificity and information content have been identified. These primers can be used for intraspecific comparisons and evaluation of the genetic diversity of the species of parasitic insects under study.

Keywords: entomophage, Habrobracon hebetor Say, RAPD-PCR, highly specific primers, DNA polymorphism, population.

Введение

Перспективным биоагентом, способным снизить химическую нагрузку на агроценозы, является Habrobracon hebetor Say., известный как эктопаразит более 60 видов чешуекрылых насекомых: хлопковой совки (Helicoverpa armigera Hbn.), огородной совки (Polia oleracea L.), совки-гамма (Autographa gamma L.), кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis Hbn.) и др. [1], [6].

Изучение популяционной генетики полезных паразитических насекомых, в том числе энтомофага Habrobracon hebetor, позволит установить причины генетической изменчивости структуры популяций и определить перспективность их дальнейшего использования для биологического контроля численности ряда вредных чешуекрылых.

Оценить генетическую структуру популяций сегодня можно с помощью молекулярно-генетического анализа и, в частности, одним из вариантов ПЦР-анализа - RAPD-PCR (randomly amplified DNA polymerase chain reaction) – случайным образом амплифицированная ДНК [9].

Данный подход относительно прост в сравнении с другими вариантами ПЦР, так как не требует знания первичной последовательности ДНК [8]. Возражения об относительно низкой воспроизводимости этих методов по сравнению с микросателлитными маркерами могут быть устранены подбором высокоспецифических к ДНК RAPD-праймеров [4], [7].

В связи с этим целью исследований было выявление высокоспецифичных RAPD-праймеров к ДНК габробракона. В задачу исследований входило тестирование набора праймеров, на специфичность и информативность, то есть вскрывающих ДНК-полиморфизм и обладающих при этом высокой специфичностью к ДНК исследуемого вида насекомых.

Материал и методы

Лабораторные исследования выполнены на базе сектора биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института биологической защиты растений. В качестве объекта исследования использовали имаго насекомых (n=20) из краснодарской популяции Habrobracon hebetor Say (Hymenoptera: Braconidae). Выделение ДНК и амплификацию (RAPD-PCR) проводили по протоколам, описанным в методических рекомендациях [3]. RAPD-амплификация проходила в следующих режимах:

1) 3 минуты предварительная денатурация при 94⁰ С,

2) 36 циклов:

– 20 секунд денатурация при 94⁰ С,

– 20 секунд отжиг при 36⁰ С,

– 60 секунд элонгация при 72⁰ С,

3) 10 минут конечный синтез при 72⁰ С.

Лабораторные опыты проводили с использованием следующего оборудования: амплификатор «iCycler» (Bio Rad, США), микроцентрифуга «MiniSpin» (Eppendorf, Германия), термостат для микропробирок «Термо 24» (Biokom, Россия), камеры для горизонтального электрофореза «Sub Cell-GT» (Bio Rad, США). Визуализацию продуктов амплификации проводили после предварительного окрашивания бромистым этидием на трансиллюминаторе ЕСХ-20-М (Vilber Lourmat, Франция). Яркость окрашивания ДНК-фрагментов оценивали визуально по сравнению с окрашиванием маркерной ДНК. Степень ДНК-полиморфизма определяли как отношение числа полиморфных ПЦР-фрагментов к общему числу ПЦР-маркеров [10].

Результаты и обсуждение

Несмотря на широкое использование, RAPD-метод имеет ряд ограничений для практического использования, среди которых относительно низкая воспроизводимость результатов, поскольку ПЦР зависит от специфичности праймера, качества и количества ДНК, концентрации ионов магния, активности полимеразы [5].

Решающим фактором, влияющим на воспроизводимость результатов RAPD-PCR, является праймер. Это объясняется тем, что многие праймеры могут иметь низкую гомологию с исследуемой ДНК («низкоспецифические» праймеры) и в результате – отсутствие ПЦР-продукта или очень малое их количество, нечеткие и слабовыраженные ДНК-фрагменты в ходе электрофореза и как результат – слабая воспроизводимость [2].

Однако некоторые даже высокоспецифичные праймеры  могут не выявлять ДНК-полиморфизм в популяциях, что в большинстве случаев тоже делает их непригодными для дальнейшего популяционно-генетического анализа. Поэтому особое внимание необходимо уделить, прежде всего, предварительному тестированию RAPD-праймеров на специфичность к ДНК исследуемого вида насекомых и информативность.

Нами был проведен скрининг 40 RAPD-праймеров на информативность и специфичность. Можно заметить, что все протестированные праймеры обладали разной степенью специфичности к ДНК эктопаразита Habrobracon hebetor (табл. 1).

Высокоспецифические RAPD-праймеры генерировали яркие и четко детектируемые ПЦР-фрагменты на электрофореграммах при отсутствии пустых дорожек. В то же время, праймеры со средней и слабой специфичностью практически не способствовали выявлению ДНК-фрагментов или имели пустые дорожки (UBC521, OPD03, OPD12). По этой причине из протестированных RAPD-праймеров в результате были отобраны семь высокоспецифичных (GT09, OPA10, OPB01, OPB04, OPC01, OPC05 и UBC519), вскрывающих генетический полиморфизм в популяции габробракона.

 

Таблица 1– Специфичность RAPD-праймеров к ДНК энтомофага Habrobracon hebetor Say

RAPD-праймер	Последовательность нуклеотидов (3’-5’)	Гуанин-цитозиновый  состав (GC, %)	Специфичность праймера
267/2	ACATAGACGG	50	средняя
GT09	TCTGCCGTGA	60	высокая
OPA01	CAGGCCCTTC	70	низкая
ОРА02	TGCCGAGCTG	70	средняя
OPA05	AGGGGTCTTG	60	низкая
ОРА06	GGTCCCTGAC	70	низкая
ОРА07	GAAACGGGTG	60	низкая
OPA09	GGGTAACGCC	70	низкая
OPA10	GTGATCGCAG	60	высокая
ОРА13	CAGCACCCAC	70	низкая
ОРА15	TTCCGAACCC	60	низкая
OPA18	AGGTGACCGT	60	средняя
ОРА20	GTTGCGATCC	60	низкая
ОРВ01	GTTTCGCTCC	60	высокая
ОРВ02	TGATCCCTGG	60	низкая
OPB04	GGACTGGAGT	60	высокая
OPB07	GGTGACGCAG	70	низкая
ОРВ08	GTCCACACGG	70	низкая
OPB10	CTGCTGGGAC	70	низкая

 

Окончание табл. 1 – Специфичность RAPD-праймеров к ДНК энтомофага Habrobracon hebetor Say

OPB18	CCACAGCAGT	60	низкая
OPC01	TTCGAGCCAG	60	высокая
OPC02	GTGAGGCGTC	70	низкая
OPC03	GGGGGTCTTT	60	низкая
OPC04	CCGCATCTAC	60	низкая
OPC05	GATGACCGCC	70	высокая
OPC08	TGGACCGGTG	70	низкая
OPC14	TGCGTGCTTG	60	низкая
ОРD03	TGGACCGGTG	70	низкая
OPD09	CTCTGGAGAC	60	низкая
OPD12	GAAACGGGTG	60	средняя
ОРЕ01	GGTGACTGTG	70	низкая
ОРЕ07	AGATGCAGCC	60	низкая
OPN15	CAGCGACTGT	60	средняя
UBC450	CGGAGAGCCC	80	средняя
UBC490	AGTCGACCTT	50	низкая
UBC519	ACCGGACACT	60	высокая
UBC521	CCGCCCCACT	80	средняя
UBC531	GCTCACTGTT	50	средняя
UBC538	TGACCTCTCC	60	низкая
UBC556	ATGGATGACG	50	средняя

 

В общей сложности по семи праймерам было выявлено 148 четко детектируемых ДНК-маркеров, среди которых определены 30 наиболее ярко выраженных. Как видно из данных, представленных в таблице 2, отобранные высокоспецифичные RAPD-праймеры выявляли четко выраженные ДНК-фрагменты с общим количеством ДНК-маркеров = 16-26 и относительно высоким средним числом ДНК-фрагментов на особь = 5.2-11.8. При этом размер фрагментов варьировал от 280 до 1700 пар нуклеотидов.

 

Таблица 2 – Полиморфизм ДНК краснодарской популяции Habrobracon hebetor Say по высокоспецифичным RAPD-маркерам

№, п/п	RAPD-праймер	Число ДНК-маркеров (шт.)	Среднее число ДНК-фрагментов на особь (шт.)	ДНК-полиморфизм (%)
1	GT09	23	7.5	60
2	ОРА10	17	6.4	100
3	ОРB01	26	9.2	80
4	ОРB04	24	7.0	60
5	OPC01	16	5.2	60
6	OPC05	17	6.0	60
7	UBC519	25	11.8	30

 

Выводы

Таким образом, сравнительный анализ спектров ДНК-фрагментов позволил выявить семь высокоспецифичных RAPD-праймеров к ДНК Habrobracon hebetor: GT09, OPA10, OPB01, OPB04, OPC01, OPC05 и UBC519, с помощью которых определены 30 четко детектируемых ДНК-маркеров. Отсюда можно сделать вывод, что выявленные в работе высокоспецифические праймеры можно использовать в RAPD-анализе изменчивости внутрипопуляционной структуры Habrobracon hebetor.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Агасьева И. С. Влияние химических и биологических препаратов на выживаемость энтомофагов вредителей кукурузы / И. С. Агасьева, Е. В. Федоренко, А. О. Мкртчян, В. Я. Исмаилов // Успехи современного естествознания. – 2018. – № 9. – С. 7-11. doi: 17513/use.36858.
2. Киль В. И. О полиморфизме RAPD-маркеров у различных таксонов полужесткокрылых (Hemiptera) / В.И. Киль, В. В. Гронин, Д. В. Крутенко и др. // Сельскохозяйственная биология. – 2008. – № 1. – C. 70-76.
3. Киль В. И. Методика оценки ДНК полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR) / В. И. Киль. – Методические рекомендации. – Краснодар : ООО «Просвещение-Юг», 2009. – 16 с.
4. Киль В. И. Использование высокоспецифических RAPD-праймеров для ПЦР-анализа популяций вредных и полезных насекомых / В. И. Киль // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2014. – № 6. – С. 21-25.
5. Киль В. И. ПЦР-анализ различных видов кокцинеллид (Coleoptera, Coccinellidae) по универсальным RAPD-маркерам / В. И. Киль, Е. Н. Беседина, И. С. Цыгикало // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2015. – № 5. – С. 29-33.
6. Greenstone M. H. Choosing natural enemies for conservation biological control: use of the prey detectability half-life to rank / M. H. Greenstone, Z. Szendrei, M. E. Payton and others // Entomol. Exp. Appl. – 2010. – Vol. 136. – P. 97–107.
7. Stevens The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for studies of genetic variation in populations of the blowfly Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) in southern England / J. Stevens, R. Wall // Bulletin of Entomological Research. – 1995. – Vol. 85. – P. 549-555. DOI: https://doi.org/10.1017/S000748530003305.
8. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Research. – – Vol. 18. – P. 7213-7218.
9. Williams J. G. K. DNA polymorphism’s amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J. G. K. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak et al. // Nucleic Acids Research. – 1990. – Vol. 18. – P. 6531-6535.
10. Yeh F. C. POPGENE, the user-friendly shareware for for population genetic analysis, version 1.31. / F. C. Yeh, R. C. Yang, T. B. J. Boyle, Z. H. Ye, J. X. Mao // University of Alberta and Centre for International Forestry Research. – 1999. – P. 102–120.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Agasieva I. S. Vlijanie himicheskih i biologicheskih preparatov na vyzhivaemost’ entomofagov vrediteley kukuruzy [The influence of chemical and biological preparations on the survival of entomophages of maize pests] / I. S. Agasyeva, E. V. Fedorenko, A. O. Mkrtchyan, V. Ya. Ismailov // Uspehi sovremennogo estestvoznanija [Successes of modern natural science]. – – № 9 – P. 7-11. doi: 10.17513/use.36858. [in Russian]
2. Kil V. I. О polimorphizme RAPD-маrkerov u razlichnyh taksonov poluzhestkokrylyh (Hemiptera) [About DNA polymorphism in different bug species (Hemiptera) with RAPD markers] / I. Kil, V. V. Gronin, D. V. Krutenko and others // Sel’skohozjaystvennaja biologija [Agricultural Вiology]. – 2008. – № 1. – C. 70-76. [in Russian]
3. Kil V. I. Metodika otsenki DNK polimorphizma populjatsiy nasekomyh s pomoshch’ju PTsR (RAPD- и ISSR-PCR) [Methods for assessing DNA polymorphism of insect populations by PCR (RAPD- and ISSR-PCR)] / V. I. Kil // – Metodicheskie rekomendatsii [Methodical recommendations]. – Krasnodar : LLC "Prosveschenie - Yug". 2009. – 16 p. [in Russian]
4. Kil V. I. Ispol’zovanie vysokospetsificheskih praymerov dlja PTsR analiza populjatsiy vrednyh i poleznyh nasekomyh [Application of highly specific RAPD primers for PCR analysis of harmful and beneficial insect populations] / V. I. Kil // Doklady rossiyskoy akademii sel’skohozjaystvennyh nauk [Reports of the Russian Academy of Agricultural Sciences]. – – № 6. – P. 21-25. [in Russian]
5. Kil V. I. PTsR-analiz razlichnyh vidov koktsinellid (Coleoptera, Coccinellidae) po universal’nym RAPD-markeram [PCR analysis of different ladybird species (Coleoptera, Coccinellidae) with universal RAPD primers] / I. Kil, E. N. Besedina, I. S. Tsigikalo // Doklady rossiyskoy akademii sel’skohozjaystvennyh nauk [Reports of the Russian Academy of Agricultural Sciences]. – 2015. – № 5. – С. 29-33. [in Russian]
6. Greenstone M. H. Choosing natural enemies for conservation biological control: use of the prey detectability half-life to rank / M. H. Greenstone, Z. Szendrei, M. E. Payton and others// Entomol. Exp. Appl. – 2010. – Vol. 136. – P. 97–107.
7. Stevens The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for studies of genetic variation in populations of the blowfly Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) in southern England / J. Stevens, R. Wall // Bulletin of Entomological Research. – 1995. – Vol. 85. – P. 549-555. DOI: https://doi.org/10.1017/S000748530003305.
8. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Research. – – Vol. 18. – P. 7213-7218.
9. Williams J. G. K. DNA polymorphism’s amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J. G. K. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak et al. // Nucleic Acids Research. – 1990. – Vol. 18. – P. 6531-6535.
10. Yeh F. C. POPGENE, the user-friendly shareware for for population genetic analysis, version 1.31. / F. C. Yeh, R. C. Yang, T. B. J. Boyle, Z. H. Ye, J. X. Mao // University of Alberta and Centre for International Forestry Research. – 1999. – P. 102–120.