ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ ЭРИТРОЦИТОВ У ЛИЦ УМЕРШИХ ОТ ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЯ

ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ ЭРИТРОЦИТОВ У ЛИЦ УМЕРШИХ ОТ ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЯ

Научная статья

Алексеев Р.З.¹, Гольдерова А.С.², Мамаева С.Н.³, Платонова В.А.⁴, Саввинова Л.Н.^5, *, Афанасьева С.С.⁶, Кычкина Т.В.⁷

¹ ORCID: 0000-0002-6451-2852,

¹ Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», Якутск, Росиия;

² ORCID: 0000-0002-6739-9453;

³ ORCID: 0000-0003-3676-5630,

^{2, 3, 4, 5, 5, 7} Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова, Якутск, Россия

* Корреспондирующий автор (liya.poryadina[at]gmail.com)

Аннотация

В данной работе представлены результаты исследования морфологии эритроцитов умершего от переохлаждения при температурных условиях Якутии (ниже -40^°С) методами растровой электронной микроскопии (РЭМ). Выявлены характерные особенности морфологии эритроцитов, проведены сравнения экспериментальных данных до и после вскрытия. До вскрытия преобладали дискоциты и только 15% составили изменнные эритроциты – эхиноциты. После вскрытия процент эхиноцитов вырос более чем в два раза. Результаты исследования могут быть использованы в формировании фундаментальных представлений о клеточных изменениях в критических состояниях и о возможных механизмах восстановления клеток и их функциональных свойств.

Ключевые слова: переохлаждение, морфология эритроцитов, растровая электронная микроскопия.

MAIN FEATURES OF ERYTHROCYTES MORPHOLOGY IN PERSONS DEAD OF HYPOTHERMIA

Research article

Alekseev R.Z.¹, Golderova A.S.², Mamaeva S.N.³, Platonova V.A.⁴, Savvinova L.N.^5, *, Afanasyeva S.S.⁶, Kychkina T.V.⁷

¹ ORCID: 0000-0002-6451-2852,

¹ Federal State Budgetary Scientific Institution “Yakut Scientific Center for Complex Medical Problems,” Yakutsk, Russia

² ORCID: 0000-0002-6739-9453;

³ ORCID: 0000-0003-3676-5630,

^{2, 3, 4, 5, 5, 7} Ammosov North-Eastern Federal University,Yakutsk, Russia

* Corresponding author (liya.poryadina[at]gmail.com)

Abstract

This paper presents the results of the study of erythrocytes morphology of the persons dead of hypothermia under the temperature conditions of Yakutia (below -40 °C) with the help of scanning electron microscopy (SEM). Characteristic features of the erythrocyte morphology were revealed, and experimental data were compared before and after prosection. Before prosection, discocytes prevailed and only 15% were altered erythrocytes, that is – echinocytes. After prosection, the percentage of echinocytes more than doubled. The results of the study can be used in the formation of fundamental ideas about cellular changes in critical states and possible mechanisms for the recovery of cells and their functional properties.

Keywords: hypothermia, erythrocyte morphology, scanning electron microscopy.

Изучение состояния эритроцитов при критических, терминальных и постреанимационных состояниях позволяет выявить, как реагируют клетки, ответственные за газообмен в организме, на сильные изменения обмена веществ, происходящие при критических состояниях, и как при этом изменяются их функциональные, структурные и биохимические свойства. Изменения морфофункциональных свойств эритроцитов приводят к нарушению газообмена, изменению рН крови, и при этом изменяется метаболизм, поскольку эритроциты являются переносчиками некоторых ферментов. Поэтому восстановление или сохранение популяции функциональных эритроцитов может решить не только проблемы, связанные с газообменом, но и восстановить метаболизм, нарушенный при критических состояниях. Необходимы дальнейшие исследования состояния эритроцитов при критических состояниях для поиска способов коррекции морфологических, функциональных и ультраструктурных изменений эритроцитов [1].

Общее охлаждение и отморожения являются одними из тяжелых видов холодовой травмы, зачастую приводящие к высокому уровню инвалидизации и летальному исходу пострадавших [2]. В настоящее время в мире до конца не изучены вопросы смерти от общего охлаждения в условиях сверхнизких температур (ниже -40°С). В реальных условиях лиц, умерших от переохлаждения (по внешним признакам) без проведения реанимационных мероприятий доставляются в морг. Немаловажным моментом, возможно считается, что в течение первых 2-х суток пострадавшие находятся в состоянии холодового анабиоза (очень редкий пульс, низкое АД) и вероятность восстановления жизнедеятельности организма не исключается (отмечаются случаи сохранения жизнедеятельности сердца и других органов у замерзших животных).

Учитывая вышеперечисленное, нам представляется интересным определение особенностей морфологии эритроцитов при воздействии на организм низких температур (-40°С) у умерших от переохлаждения в условиях Якутии.

Объекты и методы исследования

С помощью растрового электронного микроскопа JEOL-7800 с термополевой эмиссионным катодом Шоттки и супергибридной объективной линзой, с использованием нижнего детектора вторичных электронов при напряжении от 0.1 кВ до 30 кВ. Обследованы мазки крови умершего от переохлаждения неизвестного мужчины 35-40 лет, обнаруженного в окрестности г. Якутска и доставленного ночью 24.12.2017 г.  (температура воздуха -45^°С). Применение данного режима электронного микроскопа при измерениях позволяют провести исследования поверхности эритроцитов образцов крови без повреждения, не применяя при этом напыление проводящих покрытий.

Нативные мазки крови были сделаны на предметном стекле по общепринятой методике. Первые мазки  (до вскрытия) были сделаны сразу после доставки трупа в морг из области печени, т.к. проведенная термометрия внутренних органов и тканей показала максимальное значение температуры именно в печени, равную +24°С.  Вторые мазки были сделаны через двое суток после полного оттаивания трупа после вскрытия.

Результаты исследования и их обсуждение

Эритроциты периферической крови традиционно служат моделью для оценки глубины повреждения мембран при патологическом процессе, протекающем в организме.

В нашем исследовании анализ РЭМ-изображений до вскрытия трупов указывает, что в исследуемых полях зрения отмечается конгломерация эритроцитов и преобладание дискоцитов (рис.1). Только около 15% эритроцитов имеют измененную форму: содержание эхиноцитов – сферических клеток, на поверхности которых достаточно регулярно располагаются так называемые спикулы, составило всего 13,72%, а акантоцитов – 2,68%.

Рис.1 – РЭМ-изображения эритроцитов умершего от переохлаждения при увеличении в 1000х до вскрытия

 

Эхиноциты имеют на поверхности острые или тупые зубчики, сходной величины, равномерно распределенные на поверхности клетки. Эхиноциты образуются при деградации эритроцитов, увеличении рН, истощении запасов АТФ, а также при повышении уровня внутриклеточного кальция. Акантоциты – это эритроциты с беспорядочно расположенными на поверхности клетки зубчиками неодинаковой величины. Они образуются при избыточном по сравнению с фосфолипидами содержании холестерина в крови или нарушении состава липопротеинов плазмы [3]. Известно, что акантоцитарные формы эритроцитов определяются дефектом структурной мембраны [4], тогда как эхиноцитарные формы могут быть вызваны и отменены с помощью рН, осмолярности, биохимических и даже электрических изменений [5].

Исследование мазков крови, сделанных после вскрытия, т.е. после воздействия положительной комнатной температуры, процент эхиноцитов увеличился в 2,01 раза  и составило 27,58%, а процент акантоцитов - наоборот уменьшился в 3,11 раз до 0,86% по сравнению с данными до вскрытия (рис.2). Следует отметить, что конгломераты из измененных эритроцитов после вскрытия стали крупнее размером, а степень изменений мембраны эритроцитов (за счет увеличения эхиноцитов) существенно увеличилась.  Выявленные нами особенности морфологии эритроцитов при переохлаждении, а именно существенное преобладание эхиноцитов над акантоцитами, косвенно могут подтверждать возможность восстановления эхиноцитов в дискоциты, но при соблюдении определенных условий среды.

Рис.2 – РЭМ-изображения эритроцитов умершего от переохлаждения при увеличении в 1000х после вскрытия

 

Нами проведен сравнительный анализ диаметров эритроцитов до и после вскрытия трупа, который выявил статистически значимые различия (р=0,043), (7,78 ± 1,30 мкм и 6,94 ± 1,25 мкм, соответственно). Характерно, что до вскрытия преобладали эритроциты с диаметром больше 8 мкм, а после вскрытия – эритроциты менее 7 мкм (рис.3).

Рис. 3 – Распределении частот в зависимости от диаметра эритроцитов до и после вскрытия

 

Распределение эритроцитов в зависимости от диаметра на 3 группы (1 группа – менее 7 мкм; 2 группа – от 7 до 8 мкм; 3 группа – более 8 мкм)  указывает (рис.3),  что до вскрытия в крови преобладают эритроциты имеющие диаметр более 8 мкм. После вскрытия – диаметр эритроцитов уменьшается, большинство эритроцитов имеют диаметр меньше 7 мкм.

Из литературных источников известно, что в условиях окислительного стресса собственная ферментативная защита эритроцитов слабеет в связи с быстрой инактивацией конститутивного пула ферментов [6]. В связи с ингибированием ферментов нарушается процесс обмена веществ (синтез АТФ), изменяется проницаемость мембраны, снижается способность транспортировать вещества, в том числе кислород. Воздействие высоких температур также отражается на морфологии эритроцитов. Например, при гипертермии, смоделированной на крысах, происходило изменение диаметра эритроцитов [7]. Известно, что при хранении донорской крови или эритроцитарной массы при 4°С в эритроцитах снижается содержание АТФ [8, 9]. При этом изменяется морфология эритроцитов – из дискоцита они превращаются в эхиноциты [10].

Следующим этапом нашего исследования явилась сравнительный анализ особенностей спикул (отростков эхиноцитов). Оценивались длина  (n=68) и ширина (n=52) спикул до и после вскрытия. Проведенный статистический анализ показал статистически значимые различия между ними (p=0,005 и р=0,001, соответственно). Длина и ширина спикул эхиноцитов до вскрытия оказались существенно больше, чем после вскрытия (рис.4).

Таким образом, воздействие положительной комнатной температуры в течение 1 до 2 суток проявляется статистически значимым уменьшением диаметра и размеров (длина и ширина) спикул эритроцитов.

Рис.4 – Продольные и поперечные размеры спикул эхиноцитов до и после вскрытия

 

Заключение

Полученные результаты показывают наличие существенных различий в морфологии эритроцитов  и их количественного соотношения дисморфных эритроцитов, что указывает на необходимость дальнейшего изучения этой проблемы для выявления зависимости возможного восстановления клеток, их нормальной популяции и их функциональных свойств в зависимости от способа отогревания умерших от переохлаждения при определенных температурных условиях.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Мороз В. В. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях // В. В. Мороз, А.М. Голубев, А. В.Афанасьев. Общая реаниматология. – 2012. – VIII; 1. – С.52 – 60
2. Алексеев Р. З. Комплексное лечение отморожений в дореактивном периоде: автореферат дис. ... доктора медицинских наук: 14.00.22. - // Р. З. Алексеев - Москва, 1999. - 29 с.
3. Стацевич Л. Н. Атлас морфология и патология эритроцитов: электрон. учеб.-метод. Пособие / Л. Н. Стацевич, О.С. Козлова, НГАУ – Новосибирск, 2012. – 31 с.
4. Perrin J. Acanthocytes et hypercholesterolemia / J. Perrin, A. Georges, A. Morali and others. Ann BioloClin. 2008;66(5):56972.
5. Mrowietz C. Reversibility of Echinocyte Formation after Contact of erythrocytes with various Radiographic Contrast Media / C. Mrowietz, B. Hiebl, R. P. Franke. ClinHemorheolMicrocirc. 2008;39 (1–4): 281–6.
6. Чеснокова Н. П. Молекулярно- клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах. Усп. соврем. естествознания // Н. П. Чеснокова, Е. В. Понукалина, М. Н. Бизенкова - 2006; 7: 29—36.
7. Козлов Н. Б. Термоустойчивость гомойотермного организма: биохимические механизмы, пути повышения. // Н.Б. Козлов - Смоленск: изд-во СГМИ; 1992. 115.
8. Karger R. Deformability of red blood cells and correlation with ATP content during storage as leukocyte-depleted whole blood / R. Karger, C. Lukow, V. Kretschmer. Transfus. Med. 39 : 277—282.
9. Hess J. R. 2014. Measures of stored red blood cell quality / J. R. Hess. Vox Sang.107: 1—9.
10. Reinhart S. A. Studies on metabolically depleted erythrocytes / S. A. Reinhart, T. Schulzki, P. O. Bonetti, Reinhart W. H.. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2014, 56 : 161—173.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Moroz V. V. Stroenie i funkcii eritrocita v norme i pri kriticheskih sostoyaniyah // Obshaya reanimatologia [Erythrocite’s Structure and Function in normal and critical conditions // General resuscitation] / V. V. Moroz, A. M. Golubev, A. V. Afanasyev. – 2012. – VIII; 1. – P.52-60. [in Russian]
2. Alekseev R. Z. Kompleksnoe lechenie otmorojeniy v doreaktivnom periode: avtoreferat [Complex treatment of a Frostbite in Prereactive Period: autoessay] / R. Z. Alekseev dis. … DMedSc: 14.00.22 – Moskva, 1999. – 29 P. [in Russian]
3. Stacevich L. N. Atlas morfologiya i patologiya eritrocitov: electron.ucheb.-metod.posobie [Atlas Morphology and Pathology of Red Blood Cells: electronic educational-metodical manual] / L. N. Stacevich, O. S. Kozlova – National Agrarian University of Novosibirsk, 2012. – P.31 [in Russian]
4. Perrin J. Acanthocytes et hypercholesterolemia / J. Perrin, A. Georges, A. Morali and others, Ann BioloClin. 2008;66(5):56972
5. Mrowietz C. Reversibility of Echinocyte Formation after Contact of erythrocytes with various Radiographic Contrast Media / C. Mrowietz, B. Hiebl, R. P. Franke. ClinHemorheolMicrocirc. 2008;39 (1–4): 281–6.
6. Chesnokova N. P. Molekulyarno-kletochnie mehanizmy inaktivacii svobodnyh radikalov v biologicheskih sistemah. sovremennogo estestvoznaniya. [Molecular and Cellular Mechanisms of Inactivation of Free Radicals in Biological Systems] / N. P. Chesnokova, E. V. Ponukalina, M. N. Bizenkova, – 2006, P.29- 36.[in Russian]
7. Kozlov N. B. Termoustoychivost gomoyotermnogo organizma: biohimicheskie mehanizmy, puti povisheniya. [Homoiothermal Resistance of the Organism: Biochemichal Mechanisms, Ways to Increase.] / N. B. Kozlov – Smolensk publishing SHMI, 1992, P. 115 [in Russian]
8. Karger R. Deformability of red blood cells and correlation with ATP content during storage as leukocyte-depleted whole blood / R. Karger, C. Lukow, V. Kretschmer. Transfus. Med. 2012, 39 : 277—282.
9. Hess J. R. . Measures of stored red blood cell quality. Vox Sang. 107 : 1—9.
10. Reinhart S. A. Studies on metabolically depleted erythrocytes / S. A. Reinhart, T. Schulzki, P. O. Bonetti and others. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2014, 56 : 161—173.