РЕЗИСТЕНТРОСТЬ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА

Зайнетдинова А.Т.¹, Шамратова В.Г.², Шарафутдинова Л.А.³

¹Магистр, ²доктор биологических наук, профессор, ³кандидат биологических наук, доцент,

^1,2,3Башкирский государственный университет

РЕЗИСТЕНТРОСТЬ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА

Аннотация

Увеличение использования наночастиц  в различных областях, а как следствие и его потребления, диктует необходимость изучения его воздействия на организм человека. Наночастицы диоксида титана могут проникать в организм пероральным и интерназальным путем, а также через кожный эпителий, однако в любом случае первым уровнем взаимодействия являются клеточные мембраны. Данное исследование, проведенное на модели мембран эритроцитов методом кислотных эритрограмм, выявило токсический эффект исследуемых наночастиц на 15-е сутки эксперимента с восстановлением функции мембран на 30-е сутки. Эти изменения коррелировали с общим количеством эритроцитов.

Ключевые слова: диоксид титана, наноматериалы, мембраны, эритроциты.

Zaynetdinova A.T.¹, Shamratova V.G.², Sharafutdinova L.A.³

¹Master’s degree, ²PhD in Biology, Professor, ³PhD in Biology, Professor, Associate professor,

Bashkir State University

RESISTANCE OF RAT RED CELL MEMBRANES UNDER CONDITIONS OF LONG-TERM EFFECT OF TITANIUM DIOXIDE NANOPARTICLES

Abstract

Increasing the usage of the nanoparticles  in various areas, and its consumption as a consequence, leads to the need of study its effects on the human body. Nanoparticles of titanium dioxide can penetrate into the body by oral and intranasal route, as well as through the dermic epithelium, however in any case the cell membranes are the first level of interaction. This study, was performed on a model of erythrocyte membranes by the method of acid erythrograms, and revealed a toxic effect of the investigated nanoparticles on the 15^th day of the experiment with the membrane functions recovery on the 30^th day. These changes were correlated with the total number of red cells.

Keywords: titanium dioxide, nanomaterials, membranes, red cell.

Введение. В настоящее время диоксид титана ( ) входит в число самых изготовляемых и часто используемых веществ [6, C. 1097], [9, C. 8]. Широкий спектр использования   в качестве отбеливателя наблюдается в таких отраслях промышленности как пищевая, косметическая и фармацевтическая [5, C. 580]. В последнее время возрастает использование  в качестве наночастиц (НЧ), производство которых увеличивается с каждым годом. Вследствие этого многие источники НЧ  могут привести к увеличению их поступления в организм человека [10, C. 5].

Многочисленные исследования указывают на то, что НЧ  могут оказывать канцерогенное влияние на органы желудочно-кишечного тракта, печень, альвеолярную систему легких, а также на систему крови [1, C. 7]. Существуют исследования, установившие возможность НЧ  проникать в клетки, связываться  с белками и индуцировать повреждения ДНК [6, C. 1099], [7, C. 6461]. Однако сравнительный анализ различных исследований выявляет неоднозначность результатов. Так как мембраны являются мишенью экзогенных веществ [4, C.31], изучение влияния НЧ  на эритроцитарные мембраны, являющиеся  классическим примером структурной организации, свойств и стабильности всех клеточных мембран [8, C. 3628], вызывает научный интерес.

Материалы и методы. Исследование выполнено in vivo на половозрелых самках крыс линии Wistar с исходной массой 180-210 грамм. Крысам экспериментальной группы (n=14) однократно в утренние часы «per os» в течение 30 дней вводился водный раствор НЧ .  Расчет индивидуальной дозы производился исходя из соотношения 50 мг/кг массы тела животного. Забор капиллярной крови производился из кончика хвоста крыс на 15-е и 30-е сутки эксперимента. При работе с животными полностью соблюдались международные принципы Хельсинской декларации  о гуманном отношении к животным (2000 год).

Влияние на структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов оценивали методом кислотных эритрограмм по Гительзону [2, C.157]. Принцип метода основан на фотоэлектрической регистрации кинетики гемолиза, который развивается под действием кислоты во времени (измерения фиксировались каждые 30 сек). По результатам расчетов строятся дифференциальные кривые распределения эритроцитов, анализ которых проводится по таким показателям как общая продолжительность гемолиза, время начала и окончания, а также время, приходящееся на пик гемолиза [3, C. 153]. По эритрограммам рассчитывались доли клеточных популяций, разрушающихся в интервалах: 0 – 1,5 мин. (низкостойкая); 1,5 – 3 мин. (среднестойкая); от 3 мин. до 4,5 (высокостойкая) и от 4,5 до окончания гемолиза (повышенной стойкости). Количество эритроцитов определяли с помощью автоматического ветеринарного гематологического анализатора Abacus Junion VET.

Статистическую обработку полученных данных проводили c использованием пакета программ «Statistica 10.0» и программного пакета «MS Excel 2010». Статистическая значимость различий исследуемых показателей оценивалась с использованием t-критерия Стьюдента с уровнем значимости р<0,05. Для установления взаимосвязей между показателями кинетики гемолиза и общим количеством эритроцитов был проведен корреляционный анализ.

Результаты исследования. Кислотные эритрограммы по показателям контрольной группы и группы животных, подвергнутых хроническому воздействию НЧ  на 15-е и на 30-е сутки эксперимента, представлены на рис. 1.

 

Рис. 1 – Эритрограммы кислотной резистентности в контроле и под влиянием TiO2 in vivo

 

Контрольная эритрограмма имеет выраженный главный пик, приходящийся на 1,4±0,39 мин., с небольшой вершиной в области высокоустойчивых эритроцитов. Продолжительность гемолиза составляет 6,5±0,39 мин. Анализ кривой на 15-е сутки эксперимента демонстрирует, что пик приходится на 1,5±0,10 мин., что практически соответствует контрольным значениям, однако продолжительность гемолиза  составляет 3,1±0,10 мин (47,7% от контрольного значения). Таким образом, гемолиз эритроцитов на 15-е сутки эксперимента идет гораздо интенсивнее, чем в контроле. Кривая кинетики кислотного гемолиза на 30-е сутки эксперимента сдвинута вправо, вершина приходится на 2,07±0,17 мин., а продолжительность составляет 6,92±0,45 мин., что свидетельствует о восстановлении стабильности мембран.

Для общей оценки влияния TiO2 на резистентность эритроцитов были построены интегральные кривые для расчета медианы распределения (рис.2), характеризующей время разрушения половины эритроцитов. Достоверность кривых оценивалась коэффициентом детерминации R², который в среднем оказался равен 0,98.

Рис. 2 – Интегральные кривые: 1- контроль, 2 – 15-е сутки, 3 – 30-е сутки эксперимента

 

Медиана распределения в контроле приходится на 2,56±0,15 мин, на 15-е сутки опыта – на 1,73±0,11 мин, а на 30-е сутки – на 3,13±0,25 мин. Из этого следует, что 50 % клеток гораздо быстрее разрушаются на 15-е сутки эксперимента, а на 30-е сутки время разрушения половины клеток увеличивается не только по отношению к 15-м суткам, но и по отношению к контролю.

В табл. 1 отражено процентное соотношение популяций эритроцитов в контрольной и в опытной группах.

 

Таблица 1 – Процентное соотношение популяций эритроцитов с разной устойчивостью к кислотному гемолизу в контрольной и опытной группах

Показатели	Контроль	15 день	30 день
Низкостойкая популяция, %	37,10±6,30	44,65±8,92*	12,50±3,37*∆
Среднестойкая популяция, %	17,19±3,1	39,39±7,62*	44,79±3,1*∆
Высокостойкая популяция, %	20,88±4,55	15,99±3,19*	17,62±4,05
Популяция повыш. стойкости, %	23,50±5,05	0	25,66±5,83*∆

Примечание: * - статистически значимые отличия в отношении контроля (р<0,05), ∆ - статистические значимые отличия по срокам эксперимента (р<0,05)

Полученные данные свидетельствуют о том, что на 15-е сутки под влиянием НЧ повышается доля низкостойкой популяции эритроцитов, при этом отсутствуют клетки с повышенной стойкостью. Однако на 30-е сутки наблюдается значительное снижение доли низкостойкой популяции как в отношении контроля, так показателей на 15-е сутки, при этом возрастает доля среднестойкой популяции эритроцитов.

Согласно приведенным данным, стабильность мембран эритроцитов  под воздействием наночастиц  на 15-е сутки существенно снижается. Однако на 30-е сутки наблюдается восстановление показателей кинетики гемолиза, а  также снижение доли низкостойкой популяции клеток.

Мембраннотропное действие НЧ  подтвердило определение общего количества эритроцитов, которое достоверно снижалась на 15-е сутки (6,97±0,11 10¹²/л) и восстанавливалась на 30-е сутки (7,80±0,17 10¹²/л) относительно значений контроля (7,92±0,16 10¹²/л). Для установления связи общего количества эритроцитов с медианой распределения и с продолжительностью гемолиза, был проведен корреляционный анализ, согласно которому между показателями существует тесная связь: r₁=0,66 и r₂=0,58. Исходя из этого, можно заключить, что обнаруженное на 15-е сутки уменьшение числа эритроцитов в сосудистом русле обусловлено, главным образом, снижением их резистентности. Очевидно, негативное влияние НЧ на красную кровь опосредовано влиянием на структурно-функциональные свойства мембран. Об этом также свидетельствует восстановление численности эритроцитов по мере стабилизации мембран на 30-е сутки.

Список литературы / References

1. Аляхнович Н.С. Распространенность, применение и патологические эффекты диоксида титана / Н.С. Аляхнович, Д.К. Новиков // Вестник ВГМУ. – 2016. – Том 15, №2. – С. 7–16.
2. Гительзон И. И., Эритрограммы как метод клинического исследования крови / И. И. Гительзон, И. А. Терсков. – Красноярск. – 1959. – 387 с.
3. Игнатьев В.К. Анализатор стойкости эритроцитов / В.К. Игнатьев, А.В. Никитин, С.В. Храмов // Вестник ВолГУ. – 2010. – №13. – С. 151 – 157.
4. Нигматуллина А. А. Сравнительная оценка влияния iv vitro и in vivo наночастиц диоксида титана на резистентность мембран эритроцитов. / А.А. Нигматуллина Д. М. Нигматуллина // НИЦ Аэтерна. – 2016. – Ч.3, №3. – С. 31–34.
5. Фатхутдинова Л.М. Токсичность искусственных наночастиц / Л.М. Фатхутдинова, Т.О. Халиуллин, Р.Р. Залялов // Казанский медицинский журнал. – 2009. – том 90, № 4. – С. 578 – 574.
6. Ghosha M. Cytotoxic, genotoxic and the hemolytic effect of titanium dioxide (TiO2) nanoparticles on human erythrocyte and lymphocyte cells in vitro / M. Ghosha, A. Chakrabortyb, A. Mukherjeea // Applied Toxicology. – 2013. – № 33. – P. 1097 – 1110.
7. Markov D.E. Human erythrocytes as nanoparticle carriers for magnetic particle imaging / D. E. Markov, H. Boeve, B. Gleich, J. Borgert et al. // Physics in medicine and biology. – 2010. – № 55. – P. 6461 – 6473
8. Li S.Q. Nanotoxicity of TiO(2) nanoparticles to erythrocyte in vitro / S.Q. Li, R.R. Zhu, H. Zhu // Food Chem. Toxicol. — 2008. — №46 (12). — P. 3626 —3631.
9. Salomon M. Risks of synthetic nanomaterials for human health / M. Salomon // Umweltmedizin in Forschung und Praxis. – 2009. – Vol. 14, № 1. – P. 7–22.
10. Weir A. Titanium Dioxide Nanoparticles in Food and Personal Care Products /A. Weir, P. Westerhoff1, L. Fabricius, N. Goetz // NIH–PA Author Manuscript. – 2012. – № 46 (4). – P. 4 – 20.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Aljahnovich N.S. Rasprostranennost', primenenie i patologicheskie jeffekty dioksida titana [Prevalence, use and pathological effects of titanium dioxide] / R.S. Aljahnovich, D.K. Novikov // Vestnik VGMU [ VSMU Bulletin]. – 2016. – V. 15, № 2. – P. 7–16. [in Russian]
2. Gitel'zon I.I., Jeritrogrammy kak metod klinicheskogo issledovanija krovi [Erythrograms as a method of clinical blood test] / I. I. Gitel'zon, I.A. Tereskov. – Krasnojarsk. – 1959. – P 387. [in Russian]
3. Ignat'ev V.K. Analizator stojkosti jeritrocitov [Analyzer erythrocyte resistance] / V.K. Ignat'ev, A.V. Nikitin, S.V. Hramov // Vesnik VolGU [Bulletin of the Volgograd State University]. – 2010. – № 3. – P. 151 – 157.
4. Nigmatullina A.A. Sravnitel'naja ocenka vlijanija iv vitro i in vivo nanochastic dioksida titana na rezistentnost' membran jeritrocitov [Comparative evaluation of influence in vitro and in vivo titanium dioxide nanoparticles on erythrocyte resistance membranes]. / A.A. Nigmatullina, D.M. Nigmatullina // NIC Ajeterna [Scientific publishing center Ajeterna], V. 3. - 2016. – № 3. – P. 31–34. [in Russian]
5. Fathutdinova L.M. Toksichnost' iskusstvennyh nanochastic [Toxicity of artificial nanoparticles] / L.M. Fathutdinova, T.O. Haliullin, R.R. Zaljalov // Kazanskij medicinskij zhurnal [Kazan Medical Journal]. – 2009. V. 90, №4. – P. 578 – 574. [in Russian]
6. Ghosha M. Cytotoxic, genotoxic and the hemolytic effect of titanium dioxide (TiO2) nanoparticles on human erythrocyte and lymphocyte cells in vitro / M. Ghosha, A. Chakrabortyb, A. Mukherjeea // Applied Toxicology. – 2013. – № 33. – P. 1097 – 1110.
7. Markov D.E. Human erythrocytes as nanoparticle carriers for magnetic particle imaging / D. E. Markov, H. Boeve, B. Gleich, J. Borgert et al. // Physics in medicine and biology. – 2010. – № 55. – P. 6461 – 6473.
8. Li S.Q. Nanotoxicity of TiO(2) nanoparticles to erythrocyte in vitro / S.Q. Li, R.R. Zhu, H. Zhu // Food Chem. Toxicol. – 2008. – № 46 (12). – P. 3626–3631.
9. Salomon M. Risks of synthetic nanomaterials for human health / M. Salomon // Umweltmedizin in Forschung und Praxis. – 2009. – Vol. 14, № 1. – P. 7–22.
10. Weir A. Titanium Dioxide Nanoparticles in Food and Personal Care Products / A. Weir, P. Westerhoff1, L. Fabricius, N. Goetz // NIH–PA Author Manuscript. – 2012. – № 46 (4). – P. 4 – 20.