ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Научная статья

Синёв В.В.

Маляр Н.Л.

Косогорова С.А.

Постнов А.Ю.

Орехов А.Н.

Собенин И.А.

Сазонова М.А.

Выпуск: № 12 (19), 2013

Опубликована:

2014/01/16

PDF

Синёв В.В.¹, Маляр Н.Л.², Косогорова С.А.³, Постнов А.Ю.⁴, Орехов А.Н.⁵, Собенин И.А.⁶, Сазонова М.А.⁷

¹Аспирант, Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации;

² Бакалавр, Московский физико-технический институт;

³ Младший научный сотрудник, Научно-исследовательский институт атеросклероза Инновационный центр Сколково;

⁴Доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации;

⁵Доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук, Научно-исследовательский институт атеросклероза;

⁶Доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации, Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук;

⁷Кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации, Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук.

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Аннотация

Проведено пилотное исследование мутаций митохондриального генома G13513A, C3256T, T3336C, G12315A и A1555G в нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах периферической крови человека. Определение уровня гетероплазмии митохондриального генома проводилось методом пиросеквенирования ампликонов мтДНК, содержащих анализируемый однонуклеотидный полиморфизм.

Статья может быть полезна специалистам по медицинской генетике для ДНК-диагностики митохондриальных цитопатий.

Ключевые слова: мутация, гетероплазмия, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты.

Sinyov V.V.¹, Malyar N.L.², Kosogorova S.A.³, Postnov A.Yu.⁴, Orekhov A.N.⁵, Sobenin I.A.⁶, Sazonova M.A.⁷

¹ Postgraduate student, Cardiology Research Complex MH RF;

² Bachelor, Moscow Institute of Physics and Technology;

³ Junior Researcher, Institute for Atherosclerosis Research Skolkovo Innovative Centre;

⁴ Doctor of Biology, Cardiology Research Complex MH RF;

⁵ Doctor of Biology, professor, Institute of General Pathology and Patophysiology RAMS, Institute for Atherosclerosis Research Skolkovo Innovative Centre;

⁶ Doctor of Medicine, Cardiology Research Complex MH RF, Institute of General Pathology and Patophysiology RAMS;

⁷ Ph.D. in Biological Sciences, Institute of General Pathology and Patophysiology RAMS, Cardiology Research Complex MH RF.

MITOCHONDRIAL GENOME VARIABILITY IN DIFFERENT TYPES OF HUMAN BLOOD CELLS

Abstract

A pilot research of mitochondrial genome mutations G13513A, C3256T, T3336C, G12315A and A1555G in neutrophils, monocytes, and lymphocytes of human peripheral blood was carried out. Determining of the heteroplasmy level in the mitochondrial genome was conducted by pyrosequencing of mtDNA amplicons, containing the analyzed single nucleotide polymorphism.

This article can be useful for medical genetics specialists for DNA-diagnostics of mitochondrial cytopathies.

Keywords: mutation, heteroplasmy, neutrophils, monocytes, lymphocytes.

Введение

Одной из актуальных проблем современной медицины является выяснение молекулярно-генетических механизмов возникновения и развития заболеваний [1]. Исследования генома человека делают возможным раннюю, досимптоматическую диагностику различных патологий [2].

Согласно литературным данным [3-14], различные заболевания, в том числе и атеросклероз, могут быть ассоциированы с некоторыми митохондриальными мутациями. Для митохондриального генома характерно явление гетероплазмии, поэтому при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома, которой может служить процент гетероплазмии.

Митохондриальный геном отличается выраженной нестабильностью, поэтому в нем нередки мутации, возникающие в течение жизни индивида [15]. Они могут накапливаться, формируя фенотип носителя. Кроме того, ряд мутаций митохондриального генома может быть передан по наследству от матери к ребёнку [16].

Гетероплазмия митохондриального генома – это явление параллельного сосуществования нормальной и мутантной митохондриальной ДНК в пределах клетки, ткани или организма в целом.

Согласно литературным данным, гетероплазмия митохондриального генома широко представлена в нормальных клетках человека [17]. В период эмбрионального развития человека в процессе детерминации клеток и тканей возникают морфологические и химические различия между клетками организма. В результате деления клеток митохондрии распределяются между ними случайно, что обуславливает их различие в соотношении нормальных и мутантных молекул митохондриальной ДНК.

Таким образом, изучение особенности распределения и вариабельности мутантного аллеля митохондриального генома в различных клетках крови человека является актуальной задачей молекулярно-генетической диагностики.

Материалы и методы

Для исследования брали образцы крови (каждый в объеме примерно 2,5 мл) от 52 доноров.

Кровь разделяли на клеточные фракции разных типов клеток (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты) с помощью методик выделения различных фракций клеток крови на двойном градиенте плотности фиколла-урографина.

ДНК выделялась стандартным методом фенол-хлороформной экстракции.

Далее была проведена ПЦР пяти мутаций митохондриального генома, ассоциированных с различными патологиями человека (G13513A, C3256Т, T3336C, G12315A и A1555G).

Для проверки проведенной ПЦР применялось электрофоретическое разделение ампликонов.

Количественная оценка однонуклеотидных полиморфизмов митохондриального генома проводилась методом пиросеквенирования.

Статистическую оценку результатов проводили с использованием пакета SPSS версии 21.0 (SPSS Inc., США).

Результаты и обсуждение

В настоящем исследовании получены данные об уровне гетероплазмии мутаций митохондриального генома в различных типах клеток крови человека. Значения среднего процента гетероплазмии каждой из рассматриваемых мутаций представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Средний процент гетероплазмии мутаций митохондриального генома в различных типах клеток крови человека

Мутация Тип клеток	G12315A	G13513A	C1555A	C3256T	T3336C
Нейтрофилы	39,34	17,98	1,97	8,49	5,32
Моноциты	47,57	22,38	2,75	6,03	4,16
Лимфоциты	34,36	16,60	3,31	6,10	5,12

Далее была проведена статистическая обработка полученных данных с использованием Т-теста для независимых выборок (рис. 1).

Рис.1 - Значимость отличий уровня гетероплазмии в различных типах клеток крови человека

Достоверными считали различия при 95% уровне значимости. Согласно статистическим данным, достоверных различий по уровню гетероплазмии между исследованными типами клеток крови человека не выявлено. Единственным статистически значимым является различие между нейтрофилами и лимфоцитами в мутации С1555А (рис. 1) и может быть обусловлено не достаточной чувствительностью используемого метода при оценке уровня гетероплазмии ниже 5 процентов, что было подтверждено на базе нашей лаборатории в аналогичных исследованиях.

Как уже было сказано, уровень гетероплазмии в моноцитах, лимфоцитах и нейтрофилах достоверно не отличается и, следовательно, при использовании в качестве объекта исследований цельной крови, а также её компонентов, можно экстраполировать полученные данные по уровню гетероплазмии митохондриального генома определенного типа клеток крови как на общую совокупность данных клеток, так и на другие типы форменных элементов крови.

Заключение

Полученные данные по оценке уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома A1555G, C3256Т, T3336C, G12315A и G13513A свидетельствуют о том, что для исследований однонуклеотидных полиморфизмов митохондриальной ДНК репрезентативно использовать различные типы клеток крови человека.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.

Список литературы

Consigny P.M. Pathogenesis of atherosclerosis. // Am. J. Roentgenol. – 1995. – V.164, № 3. – P.553-558, Review.
Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. и др. Геном человека и «гены предрасположенности» (Введение в предиктивную медицину). – СПб.: Интермедика. – 2000. – 271 с.
Сазонова М.А., Желанкин А.В., Иванова М.М. и др. Анализ митохондриальной мутации A1555G в тотальных гомогенатах атеросклеротических поражений. // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2012. – Т. 2, № 39. – С. 72-73.
Иванова М.М., Сазонова М.А., Орехов А.Н. и др. Некоторые мутации митохондриального генома человека, ассоциированные с цитопатиями. // Биомедицинский журнал Medline.ru. – 2012. – Т. 13, № 26. – С. 309-330.
Сазонова М.А., Синёв В.В., Чичёва М.М. и др. Анализ гетероплазмии некоторых генов субъединиц NADH дегидрогеназы в гомогенатах атеросклеротического поражения интимы аорты. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2012. – № 4. – С. 71-74.
Sazonova M.A., Budnikov Y.Y., Khazanova Z.B., et al. Direct quantitative assessment of mutant allele in mitochondrial genome in atherosclerotic lesion of human aorta. // Atherosclerosis Suppl. – 2007. – V.8, №1. – P.45-46.
Postnov A.Y., Sazonova M.A., Budnikov Y.Y., et al. Association of somatic mitochondrial mutations with atherosclerosis. // Atherosclerosis Suppl. – 2007. – V.8, №1 – P.46.
Sazonova M.A., Andrianova I.V., Khasanova Z.B., et al. Quantitative mitochondrial genome mutation investigation and possible role of the somatic mutations in development of atherosclerotic lesion of human aorta. // 77th Congress of European Atherosclerosis Society, Istanbul, Turkey, April 26-29, 2008. Atherosclerosis Suppl. – 2008. – Vol.9, № 1. – P.113.
Sazonova M.A., Budnikov Ye.Ye., Khazanova Z.B., et al. Possible role of somatic mitochondrial mutations in the development of atherosclerotic lesion of human aorta. // J. Am. Coll. Cardiol. – 2008. – Vol.51, № 10. – Suppl.A:A285.
Sazonova M.A., Sobenin I.A., Orekhov A.N., et al. Studies of the human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome. // Atherosclerosis. – 2009. – Vol.204, № 1. – P.184-190.
Sobenin I.A., Sazonova M.A., Postnov A.Y., et al. Mitochondrial Mutations are Associated with Atherosclerotic Lesions in the Human Aorta. // Clin. Dev. Immunol. – 2012. – 2012:832464. – Epub 2012 Sep 11.
Sobenin I.A., Sazonova M.A., Ivanova M.M., et al. Mutation C3256T of Mitochondrial Genome in White Blood Cells: Novel Genetic Marker of Atherosclerosis and Coronary Heart Disease. // PLoS One. – 2012. – Vol.7, №10. – doi: 10.1371/journal.pone.0046573. – Epub 2012 Oct 2.
Сазонова M.A., Нурбаев С.Д., Чичёва М.М. и др. Детекция митохондриальных мутаций генов цитохромов B и C в липофиброзных бляшках интимы аорты человека. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2012. – № 4. – С. 62-66.
Сазонова М.А., Синёв В.В., Чичёва М.М. и др. Ассоциация гетероплазмии мутаций митохондриальных генов РНК с гомогенатами пораженной атеросклерозом интимы аорты. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2012. – № 4. – С. 67-70.
Желанкин А.В., Сазонова М.А. Ассоциация мутаций митохондриального генома человека с хроническими заболеваниями невоспалительного генеза: сахарным диабетом 2 типа, артериальной гипертонией и различными видами кардиомиопатии. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2012. – № 3. – С. 124-129.
Иванова М.М., Бородачёв Е.Н., Сазонова М.А. Заболевания человека, ассоциированные с мутациями митохондриального генома. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2012. – 3. – С. 115-122.
Hongzhi Li, Danhui Liu, Jianxin Lu, Yidong Bai. Physiology and Pathophysiology of Mitochondrial DNA. // Advances in Mitochondrial Medicine, Advances in Experimental Medicine and Biology. – 2012. – P.45.