МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ГАПЛОГРУППЫ И ДОКЛИНИЧЕСКИЙ АТЕРОСКЛЕРОЗ: ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ROCHE 454

Желанкин А.В.¹, Синёв В.В.², Хасанова З.Б.³, Баринова В.А.⁴, Постнов А.Ю.⁵, Сазонова М.А.⁶, Орехов А.Н.⁷, Собенин И.А.⁸

¹ Кандидат биологических наук, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ; ²аспирант, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ;  ³Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ;  ⁴аспирант, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ;  ⁵доктор медицинских наук, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ; ⁶кандидат биологических наук, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ;  ⁷доктор биологических наук, профессор, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН; НИИ атеросклероза, инновационный центр Сколково;  ⁸доктор медицинских наук, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ГАПЛОГРУППЫ И ДОКЛИНИЧЕСКИЙ АТЕРОСКЛЕРОЗ: ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ROCHE 454

Аннотация

Генетическая предрасположенность играет важную роль среди факторов риска таких мультифакторных социально значимых заболеваний, как атеросклероз и его клинические проявления. Данное пилотное исследование направлено на выявление взаимосвязи между типом митохондриальной гаплогруппы и риском доклинического атеросклероза у человека. Для точного выявления митохондриальных гаплогрупп было проведено высокоэффективное секвенирование митохондриального генома с использованием технологии Roche 454. Результаты исследования показали, что в российской популяции принадлежность к гаплогруппе H ассоциирована с повышенным риском атеросклероза, а принадлежность к гаплогруппам T и U – со сниженным риском. Полученные данные могут быть использованы для оценки индивидуального риска атеросклероза и дальнейшего изучения роли отдельных мутаций митохондриального генома в развитии атеросклероза и его клинических проявлений.

Ключевые слова: атеросклероз, гаплогруппа, митохондриальный геном, секвенирование нового поколения.

Zhelankin A.V.¹, Sinyov V.V.², Khasanova Z.B.³, Barinova V.A.⁴, Postnov A.Yu.⁵, Sazonova M.A.⁶, Orekhov A.N.⁷, Sobenin I.A.⁸

¹PhD in Biology, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;  ²Postgraduate student, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;  ³Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;  ⁴Postgraduate student, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health; ⁵Doctor of science in Medicine, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health; ⁶PhD in Biology, Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences; Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;  ⁷Doctor of science in Biology, professor, Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences; Institute for Atherosclerosis Research, Skolkovo Innovative Center; ⁸Doctor of science in Medicine, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health; Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences

MITOCHONDRIAL HAPLOGROUPS AND SUBCLINICAL ATHEROSCLEROSIS: A PILOT STUDY USING ROCHE 454 NEXT-GENERATION SEQUENCING TECHNOLOGIES

Abstract

Genetic predisposition plays an important role among other risk factors in multifactorial socially significant diseases such as atherosclerosis and its clinical manifestations. This pilot study was aimed to identify the relationship between the type of mitochondrial haplogroup and the risk of subclinical atherosclerosis in humans. For accurate detection of mitochondrial haplogroups, high-throughput sequencing of the mitochondrial genome using the Roche 454 technology was carried out. The results have shown that in Russian population, the belonging to haplogroup H is associated with an increased risk of atherosclerosis, but belonging to haplogroups T and U is associated with reduced risk. The data obtained can be used to assess individual risk of atherosclerosis and for further studies on the role of mitochondrial genome mutations in the development of atherosclerosis and its clinical manifestations.

Keywords: atherosclerosis, haplogroup, mitochondrial genome, next-generation sequencing.

Введение

Атеросклероз является наиболее распространенной патологией в современном обществе и морфологической основой для развития сердечно-сосудистых заболеваний. Вклад клинических проявлений атеросклероза в общую смертность в России и в большинстве индустриальных стран является наиболее весомым [1]. В связи с этим, большое значение имеет ранняя диагностика доклинического атеросклероза, в том числе с использованием генетических биомаркеров повышенного риска. Одним из аспектов индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу являются мутации митохондриального генома человека [2, 3]. Ряд исследований подтверждает, что принадлежность человека к той или иной митохондриальной гаплогруппе, определяемой на основе совокупности наследуемых мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), может влиять на прогрессирование различных мультифакторных заболеваний, в том числе сахарного диабета 2-го типа, рака пищевода и болезни Альцгеймера [4 - 7]. Так, Palacin и соавторы обнаружили, что принадлежность к гаплогруппе H ассоциирована с ранним инфарктом миокарда в популяции Астурии (север Испании) [8]. Также выявлена повышенная встречаемость гаплогруппы T у лиц, страдающих ишемической болезнью сердца, в популяции Австрии [9]. Ассоциация митохондриальных гаплогрупп с сердечно-сосудистыми заболеваниями атеросклеротического генеза позволяет предположить наличие взаимосвязи однонуклеотидных замен мтДНК, определяющих гаплогруппы, с развитием атеросклероза.

Материалы и методы

Обследованная выборка составила 77 человек (34 мужчины [м] и 43 женщины [ж]) из Москвы и Московской области, со средним возрастом 63,0 лет (м: 60,5, ж: 64,9). 45 участников исследования (м: 23, ж: 22) характеризовались наличием атеросклеротических поражений сонных артерий по результатам ультрасонографического исследования (средний возраст 63,2 лет, м: 60,0, ж: 66,5). Количество условно здоровых доноров составило 32 (м: 11, ж: 21) со средним возрастом 62,7 лет (м: 61,6, ж: 63,2). Артериальная гипертония, сахарный диабет и перенесенный инфаркт миокарда были критериями исключения при формировании выборки.

Ультрасонография сонных артерий

Для оценки состояния стенки сонных артерий проводили ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц на ультразвуковом сканере SonoScape SSI-1000 (Китай). Результаты ультрасонографического исследования - значения средней толщины интимо-медиального слоя (ТИМС) и наличие атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий - приведены в табл. 1.

Таблица 1 - Ультрасонографические характеристики сонных артерий в различных возрастных группах

Возрастная группа	Средняя ТИМС, мкм (кол-во участников)				Доля пациентов с наличием стеноза сосудов более 20%
	Больные атеросклерозом		Условно здоровые		Больные атеро-склерозом	Условно здоровые
	м	ж	м	ж
До 50 лет	1,03 (4)	-	0,70 (1)	0,58 (1)	0,00	0,00
51-60 лет	1,09 (5)	0,91 (4)	0,71 (3)	0,62 (8)	0,50	0,00
61-70 лет	1,01 (13)	1,04 (13)	0,77 (5)	0,67 (9)	0,62	0,00
Старше 70 лет	0,94 (1)	1,17 (5)	0,79 (2)	0,73 (3)	0,67	0,00

Для характеристики доклинического атеросклероза сонных артерий были использованы пограничные возрастно-половые значения ТИМС для жителей Московского региона [10]. При наличии атеросклеротической бляшки со стенозом сонной артерии более 20% или при наличии утолщения интимо-медиального слоя, превышающего границу 75-й процентили, а также при совокупности этих факторов, лицам присваивалась принадлежность к группе больных доклиническим атеросклерозом. Условно здоровые участники исследования характеризовались значениями ТИМС, не превышающими медианное значение для данной возрастной группы, а также отсутствием атеросклеротических бляшек (для ряда пациентов - наличием стеноза не более 20%).

Определение липидных показателей крови и индекса атерогенности

Забор крови производили натощак из локтевой вены, в качестве антикоагулянта использовали 0,1 М Na-ЭДТА (pH=8,0). Содержание общего холестерина и триглицеридов определяли ферментативным методом с помощью наборов Fluitest (Analyticon Biotechnologies AG, Германия). Содержание холестерина липопротеидов высокой плотности определяли также ферментативным методом после осаждения липопротеидов других классов с помощью преципитирующего реагента Fluitest (Analyticon Biotechnologies AG, Германия). Содержание холестерина липопротеидов низкой плотности определяли по формуле Фридевальда. Липидный индекс атерогенности рассчитывали, как соотношение холестерина липопротеидов низкой плотности к холестерину липопротеидов высокой плотности.

Выделение ДНК и обогащение мтДНК

ДНК из замороженной цельной крови выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. После выделения тотальной ДНК было проведено обогащение митохондриальной ДНК с использованием набора Qiagen™ REPLI-g Mitochondrial Kit. В 50 мл реакционной смеси было внесено около 50 нг исходной ДНК. Полученная обогащенная фракция ДНК содержала фрагменты размером 10-15 тыс. пар нуклеотидов.

Секвенирование

Для проведения высокоэффективного секвенирования митохондриального генома была использована система Roche 454 GS Junior Titanium. Из обогащенной мтДНК фракции отбирали 500 нг - количество, необходимое для создания библиотеки фрагментов ДНК и дальнейшего секвенирования. Пробоподготовка для секвенирования была проведена в соответствии с рекомендациями производителя и с использованием соответствующих реагентов. Запуск прибора и анализ качества секвенирования проводились посредством программ GS Sequencer и GS Run Browser.

Анализ и статистическая обработка результатов

Анализ последовательностей митохондриальных ДНК производился с использованием программы GS Reference Mapper. Для картирования использовалась Кембриджская эталонная последовательность митохондриального генома человека NC_012920.1 [11].

Статистический анализ данных проводился с использованием программных пакетов Microsoft Excel 2010 и IBM SPSS Statistics v.21.0. Для определения митохондриальных гаплогрупп использовалась программа MitoTool, а также интернет-ресурсы http://www.mitomap.org/ и http://www.phylotree.org/.

Результаты и обсуждение

Эффективность секвенирования

Основные параметры, по которым можно определить качество секвенирования, представлены в таблице 2. Исходя из этих параметров, несмотря на относительно низкий процент картируемых прочтений от их общего количества, можно сделать вывод о том, что при секвенировании было обеспечено в среднем 70-кратное покрытие митохондриального генома, достаточное для высокоточной детекции однонуклеотидных замен.

Таблица 2 - Эффективность секвенирования митохондриального генома человека с использованием системы 454 Roche GS Junior Titanium

Средняя длина прочтения, п.н.	Среднее количество прочтений	Среднее количество нуклеотидов, млн п.н.	Средний процент картируемых прочтений от общего количества, %
432,8 ± 4,3	2653 ± 317	1,15 ± 0,14	16,4 ± 1,8

Митохондриальные гаплогруппы и повышенный риск атеросклероза

Возможности секвенирования с использованием технологии Roche 454 позволили максимально точно определить гаплогруппу митохондриального генома, учитывая совокупность всех однонуклеотидных замен на протяжении мтДНК. Среди здоровых лиц были представлены следующие гаплогруппы: H1, H11a1, H15a1, H1a, H1a1, H2a2a1, H49, H4a1a1a, HV5, J1c2r, J1c4, J1c4b, J2a1a1, K1a9, M10a1a2, N1b1a2a, T1a1, T2a1a, T2b, T2b25, T2b3, U2e1b1, U3b, U4a2b, U4d2, U5a2a1, U5a2b1, U7b, U8a1a1b, V1a1; среди лиц с доклиническим атеросклерозом: D4e4, H1, H13a1a1, H1b2, H1bk, H1c, H1e4, H2a1a, H2a1c, H2b, H3h, H4, H46b, H5a1a, H5a1q, H5a2, H6a1a, H85, HV0a1, HV5, I1a1a, I3a, J1b1a1, J1c4, J1c4b, J1d3b, J2a1a1a3, K1c, R1a1a1, T1a1, T2b4, T2e2, U2e1, U2e1b1, U4a1, U5a1b1, U5a2a1b, U5b2b, U8a1a1, W1e, W3a1.

В исследованной выборке гаплогруппы H, U, T и J были наиболее распространенными (85,7% случаев), что соответствует общим данным по российской популяции [12]. Гаплогруппы I, W, R и D были представлены только среди лиц с доклиническим атеросклерозом; в свою очередь, гаплогруппы N, V и M были обнаружены только среди условно здоровых лиц (табл. 3). При подсчете соотношения шансов для доклинического атеросклероза установлено, что среди наиболее распространенных гаплогрупп принадлежность к гаплогруппе H ассоциирована с повышенным риском атеросклероза (χ²=3,97, p=0,046; OR=2,76, 95%CI 1,01–7,58), а принадлежность к гаплогруппам T и U – со сниженным риском (OR=0,31 и OR=0,57, соответственно). Полученные данные по гаплогруппе H согласуются с исследованием раннего инфаркта миокарда, проведенным Palacin и соавторами на популяции Астурии [8]. Однако следует учитывать, что в астурийской популяции гаплогруппа H встречается заметно чаще, чем в российской (54,1% против 41,2%), а гаплогруппа T – заметно реже (1,1% против 9,2%). Результаты данного исследования расходятся с данными, полученными на популяции Австрии, где наблюдается тенденция к повышенному риску ИБС у лиц с гаплогруппой T. Это может быть объяснено недостаточным размером исследованной выборки, а также тем, что бессимптомный атеросклероз не имеет клинических проявлений ИБС.

Таблица 3 - Распространенность основных гаплогрупп митохондриального генома в исследованной выборке, %

Гаплогруппа	H	U	T	J	I	W	K	M	N	V	D	R
Условно здоровые	31,3	25,0	18,8	12,5	0,0	0,0	3,1	3,1	3,1	3,1	0,0	0,0
Больные атеросклерозом	51,1	15,6	6,7	11,1	4,4	4,4	2,2	0,0	0,0	0,0	2,2	2,2

Не было обнаружено достоверных различий между значениями липидных характеристик крови, в частности липидного индекса атерогенности, как между лицами, принадлежащими к различным гаплогруппам, так и между группами с наличием и отсутствием доклинического атеросклероза. Тем не менее, среднее значение индекса атерогенности в группе больных доклиническим атеросклерозом было несколько повышено по сравнению с контрольной группой (3,02±1,65, против 2,7±1,10).

Таким образом, результаты данного пилотного исследования говорят о том, что принадлежность к митохондриальной гаплогруппе Н ассоциирована с повышенным риском доклинического атеросклероза. В целом, повышенный риск атеросклероза и его клинических проявлений (например, инфаркта миокарда) у представителей гаплогруппы H может быть связан с различиями в функциональной активности митохондрий. Известно, что повышенный окислительный стресс играет немаловажную роль в патогенезе атеросклероза и его клинических последствий [13]. Для митохондрий, принадлежащих к гаплогруппе Н, была обнаружена повышенная функциональная активность по сравнению с другими гаплогруппами на основании анализа интенсивности окислительного фосфорилирования и активности цитрат-синтазы [14].

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.