Экспериментальная церебральная ишемия и биомаркеры повреждения печени

Существующая стратегия лечения ишемического инсульта, направленная исключительно на защиту нейронов, до настоящего времени не приносит желаемых результатов. Системный характер патологического процесса с вовлечением микроциркуляторного русла, в том числе печени при инсульте, требует уточнения патогенетических механизмов, в рамках которых реализуется концепция оси мозг-печень. Общеизвестным является факт развития печёночной энцефалопатии в ответ на декомпенсацию печёночной функции (синтетической и детоксикационной) при циррозе. Влияние же системного нарушения микроциркуляции с развитием церебральной ишемии на функцию печени изучено недостаточно. Существующие биохимические маркеры не позволяют количественно оценить вовлеченность микроциркуляторного русла и его тяжесть. Определение того, является ли повышение печеночных ферментов предиктором смертности при инсульте или печеночная дисфункция может рассматриваться в качестве маркера тяжести инсульта, или активного фактора, усугубляющего повреждение мозга, крайне актуально для клинической практики

Сосудистая сеть конъюнктивы является частью общего микроциркуляторного русла организма и доступна для прямой визуализации. Изменения в ней отражают системные процессы, происходящие в периферических сосудах, в том числе в головном мозге и в печени. Изменения показателя средней перфузии (М) в конъюнктиве ассоциированы с аналогичными отклонениями в периферической перфузии, отражая ранние стадии поражения и предшествуя органическим повреждениям центральной нервной системы ЦНС и печени

Исследование динамических корреляционных связей между биохимическими показателями функции печени и параметрами конъюнктивальной микроциркуляции представляет собой перспективный подход для изучения функциональных взаимосвязей в системе «мозг-печень-микроциркуляторное русло». Целью данного исследования является установление корреляций между маркерами печеночной дисфункции и показателями микроциркуляции при экспериментальной церебральной ишемии.

Эксперименты выполнены на 90 крысах-самцах линии WKY (Wistar Kyoto) массой 350 ± 50 г, полученных из Биоколлекции Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Исследование проводили в соответствии с директивами Европейского союза 2010/63/EU по охране животных, используемых в научных целях. Протокол экспериментов был одобрен Биоэтическим комитетом Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (протокол № 03/17 от 17.03.2025).

За 7 дней до операции животных размещали в виварии с 12-часовым световым циклом. Содержание осуществляли групповым методом в клетках со свободным доступом к воде и корму ad libitum. Были сформированы три группы животных: опытная группа с моделью ишемии (n = 35), группа ложной операции (sham-operated, n = 20) и интактная контрольная группа (n = 35).

За 5 дней до операции в течение 4 последовательных дней всем животным измеряли артериальное давление с помощью системы неинвазивного измерения АД «Систола» (Netrobotics, Россия). Животных фиксировали в специальном держателе на термостатированной подушке с температурой 37°C. Плетизмографический датчик давления размещали на хвосте животного. После 10-минутной адаптации проводили серию из 10 измерений артериального давления с последующим расчетом средних значений систолического (САД) и диастолического (ДАД) давления. Продолжительность экспериментального наблюдения составила 7 суток.

Модель ишемии создавали в бассейне левой средней мозговой артерии по стандартному протоколу транзиторной окклюзии (rMCAO), который считается «золотым стандартом» для моделирования инсульта с последующей реперфузией у грызунов. Оперативное вмешательство проводили с использованием внутрибрюшинного введения комбинации золетила (тилетамин/золазепам, Virbac 100, Франция) в дозе 50 мг/кг и ксилазина (Interchemiewerken «De Adelaar B.V.», Нидерланды) в дозе 10 мг/кг.

Всем животным проводили лазерную допплеровскую флоуметрию (ЛДФ) с использованием прибора «ЛАКК-ОП» (Россия). Оценивали интегральный показатель микроциркуляции — перфузию (М) бульбарной конъюнктивы, которая измерялась в перфузионных единицах (PU). Двигательную функцию оценивали по шкале Бедерсона до и после операции. Критерии шкалы: 0 баллов — отсутствие неврологического дефицита; 1 балл — неспособность полностью разогнуть контралатеральную переднюю лапу; 2 балла — снижение хватательной способности контралатеральной конечности при легком подтягивании хвоста; 3 балла — спонтанное движение по кругу в контралатеральную сторону.

Биохимические показатели сыворотки крови, включая концентрацию альбумина (г/л), аланинаминотрансферазы (АЛТ, Ед/л), мочевой кислоты (мкмоль/л) и сывороточного железа (мкмоль/л), определяли у животных с моделированной церебральной ишемией. Забор крови проводили через 60 минут после начала ишемии и на 7-е сутки реперфузионного периода с последующей эвтаназией методом декапитации. Декапитация проводилась под глубокой анестезией, чтобы избежать болевых ощущений. Пробоподготовка включала отстаивание крови в течение 15 минут для формирования сгустка с последующим центрифугированием в течение 20 минут при 3000 g.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA 12. Данные с нормальным распределением анализировали с использованием t-критерия Стьюдента. Для данных, распределение которых отличалось от нормального, применяли U-критерий Манна-Уитни. Данные представлены в формате M ± SE или Me [Q1; Q3] в зависимости от соответствия распределения нормальному закону. Различия считали статистически значимыми при *p < 0,05. Корреляционный анализ между параметрами конъюнктивального кровотока и уровнем биохимических маркеров в каждой временной точке проводили с вычислением коэффициента корреляции Спирмена. Минимальный размер выборки, необходимый для выявления статистически значимых различий между группами, определяли с помощью анализа мощности (Power Analysis).

Крысы с церебральной ишемией в остром периоде значимо не отличались по массе тела от крыс группы ложно-оперированного и интактного контроля. Хирургическая процедура у животных этой группы не вызывала повреждений. Состояние животных характеризовалось отсутствием неврологического дефицита (0 баллов), САД 130± 5 ДАД 70 ± 3 мм рт. ст. нормальной микроциркуляцией в конъюнктиве глаз (левый глаз 28,8 ± 3,5 PU) и (правый глаз 29,3 ± 2,2 PU) стабильным артериальным давлением на всех этапах наблюдения (3ч, 24ч, 48ч, 7 дней).

Через 2 часа после окклюзии средней мозговой артерии (СМА) оценка по шкале Бедерсона составила 2 балла. САД повысилось до 157 ± 5 мм рт. ст., диастолическое (ДАД) — 95 ± 3 мм рт. ст. Перфузия конъюнктивы снизилась более чем на 50%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): левый глаз 13,5* ± 2,1, правый глаз 13,1* ± 1,9. Биохимические показатели: концентрация альбумина снизилась до 85%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 43,0 ± 1,9 г/л; MCAo= 36,6 ± 2,1 г/л. Активность АЛТ повысился до 187%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham=56,0 ± 8,2 Ед/л; MCAo=104,7* ± 12,2 Ед/л. Концентрация сывороточного железа в группе ишемии снизилась до 80%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 41,6 ± 2 мкмоль/л; MCAo =33,3 ± 10,0 мкмоль/л. Концентрация мочевой кислоты повысилась до 120%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 89,6 ± 10 мкмоль/л; MCAo= 107,5 ± 9,0 мкмоль/л; p >0,05.

Через 24 часа после окклюзии средней мозговой артерии (СМА) оценка по шкале Бедерсона оставалась на прежнем уровне 2 балла. САД стабилизировалось до 130 ± 9 мм рт. ст., ДАД — 85 ± 5 мм рт. ст. Перфузия конъюнктивы понизилась до минимального уровня 45%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): левый глаз 12,2* ± 1,1, правый глаз 13,6 ± 2,1*. Биохимические показатели: концентрация альбумина понизилась до 70%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 43,0 ± 1,9 г/л; MCAo= 30,1* ± 1,2 г/л. Активность АЛТ значительно повысилась до 193%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham=56,0 ± 8,2 Ед/л; MCAo=108* ± 12,3 Ед/л. Концентрация железа сыворотки крови у животных как в группе ишемии снизилась до 70%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 41,6 ± 2 мкмоль/л; MCAo =29,1 ± 10.0 мкмоль/л. Концентрация мочевой кислоты у животных в группе ишемии повысилась до 150 %, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 89,6 ± 10 мкмоль/л; MCAo= 134,4*± 10.0 мкмоль/л.

Через 48 часов после окклюзии средней мозговой артерии (СМА) оценка по шкале Бедерсона составила 1 балл (*p < 0,05). САД понизилось до 123 ± 5 мм рт. ст., ДАД— 66 ± 5 мм рт. ст.. Перфузия конъюнктивы восстановилась до 65%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): левый глаз 19,0 ± 5,1, правый глаз 22,0 ± 3,0. Биохимические показатели: концентрация альбумина снизилась до 75%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 43,0 ± 1,9 г/л; MCAo= 32,3* ± 1,2 г/л. Активность АЛТ повысилась до 200%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham=56,0 ± 8,2 Ед/л; MCAo=112* ± 12,3 Ед/л. Концентрация сывороточного железа в группе ишемии снизилась до 65% p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 41,6 ± 2 мкмоль/л; MCAo =27,1 ± 10,0 мкмоль/л. Концентрация мочевой кислоты повысилась до 120%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 89,6 ± 10 мкмоль/л; MCAo= 107,5 ± 4,0 мкмоль/л.

Через 7 дней после окклюзии средней мозговой артерии (СМА) оценка по шкале Бедерсона составила (0 баллов), соответствуя показателям контрольной группы. Артериальное давление нормализовалось до предоперационного уровня: САД = 130 ± 3 мм рт. ст., ДАД = 70 ± 5 мм рт. ст. Перфузия конъюнктивы стабилизировалась на уровне 85%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): левый глаз 27,0 ± 3,1, правый глаз 28,0 ± 1,0. Биохимические показатели: концентрация альбумина нормализовалась до 93%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 43,0 ± 1,9 г/л; MCAo= 40,0 ± 1,2 г/л. Активность АЛТ оставалась повышенной до 111%, *p < 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham=56,0 ± 8,2 Ед/л; MCAo=62* ± 3,3 Ед/л; Концентрация сывороточного железа в группе ишемии оставалась сниженной до 75%, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 41,6 ± 2 мкмоль/л; MCAo =31,2 ± 10,0 мкмоль/л. Концентрация мочевой кислоты нормализовалась до исходного значения, p > 0,05 vs Sham-группа (n=20): Sham= 89,6 ± 10 мкмоль/л; MCAo= 90,3 ± 9,0 мкмоль/л.

Наблюдается временная взаимосвязь между пиком ишемии, максимальным неврологическим дефицитом и компенсаторной артериальной гипертензией. Статистически значимое снижение неврологического дефицита с 2 до 1 балла в период между 48 часами и 7 сутками (*p < 0,05) подтверждает, что наблюдаемое улучшение не является случайной флуктуацией, а отражает реальный восстановительный процесс. Полное отсутствие неврологического дефицита к 7-м суткам свидетельствует о восстановлении функций, что характерно для модели транзиторной ишемии, при которой повреждение носит обратимый характер.

Корреляционный анализ, проведенный с использованием непараметрического критерия Спирмена, выявил статистически значимые взаимосвязи между параметрами микроциркуляции бульбарной конъюнктивы и биохимическими маркерами системного ответа на церебральную ишемию. Обнаружена умеренная отрицательная корреляция между показателем M и систолическим артериальным давлением (ρ = -0,534; p = 0,001). Выявлена умеренная отрицательная корреляция между M и уровнем альбумина (ρ = -0,490; p = 0,003). Зарегистрирована умеренная положительная корреляция между M и уровнем мочевой кислоты (ρ = 0,636; p < 0,001). Выявлена сильная отрицательная корреляция между систолическим артериальным давлением и уровнем мочевой кислоты (ρ = -0,738; p < 0,001). Обнаружена умеренная положительная корреляция между систолическим артериальным давлением и уровнем альбумина (ρ = 0,327; p = 0,055), приближающаяся к статистической значимости. Установлена умеренная отрицательная корреляция между уровнем альбумина и мочевой кислоты (ρ = -0,558; p < 0,001). Выявлена умеренная положительная корреляция между альбумином и уровнем сывороточного железа (ρ = 0,532; p = 0,001). Не получено статистически значимых корреляций между показателем M и активностью АЛТ (ρ = 0,237; p = 0,170); показателем M и уровнем сывороточного железа (ρ = -0,212; p = 0,221); активностью АЛТ и уровнем альбумина (ρ = -0,181; p = 0,299).

Современная парадигма рассматривает острый инсульт не только как локальное повреждение мозга, но и как системное нейроваскулярное заболевание. Церебральная ишемия вызывает не только неврологический дефицит, но и значительные системные гемодинамические нарушения. В наших экспериментах через 2 часа реперфузии конъюнктивальный кровоток снизился до 47% от исходного уровня, а через 24 часа — до 45%. Таким образом, в реперфузионном периоде сосуды конъюнктивы утрачивают способность адекватно реагировать на изменения системного артериального давления. Наблюдаемое снижение показателей конъюнктивального кровотока соответствует феномену «микроциркуляторной реперфузионной дисфункции» 

Церебральная ишемия в нашем исследовании сопровождалась развитием гипоальбуминемии: через 2 часа реперфузии концентрация альбумина снизилась до 85%, а через 24 часа — до 70% от исходного уровня. Основной механизм снижения концентрации альбумина, по-видимому, связан с повышением проницаемости эндотелия капилляров. Будучи низкомолекулярным белком, альбумин выходит в интерстициальное пространство, что приводит к снижению его концентрации в крови. Таким образом, раннее снижение уровня альбумина, вероятно, имеет перераспределительный характер и не связано с усиленным катаболизмом или нарушением синтеза. Сохраняющаяся гипоальбуминемия, однако, может служить маркером не только продолжающегося системного воспаления, но и развивающегося нарушения церебро-печеночных взаимодействий. В рамках формирующегося церебро-печеночного синдрома это отражает опосредованное ишемическим повреждением мозга угнетение белково-синтетической функции печени

Несмотря на ограниченность данных о печеночной дисфункции при церебральной ишемии, установлено, что механизмы повреждения головного мозга и печени тесно взаимосвязаны. Выявленное в нашем исследовании двукратное увеличение активности АЛТ подтверждает системный характер церебральной ишемии, выходящий за пределы центральной нервной системы и затрагивающий гепатобилиарную систему. Статистически значимое, хотя и умеренное, повышение активности АЛТ свидетельствует о развитии цитолитического процесса в гепатоцитах. Этот факт подтверждает, что печень, как центральный орган метаболизма и детоксикации, активно вовлекается в системный патологический ответ на церебральную ишемию

В нашем исследовании через 2 часа реперфузии концентрация сывороточного железа снизилась до 80%, а через 24 часа — до 70% от исходного уровня. Можно предположить, что ишемия головного мозга запускает синтез гепсидина в печени, что приводит к перераспределению сывороточного железа. Активация данного механизма ограничивает доступность железа в системном кровотоке, что объясняет развитие анемии хронического заболевания у пациентов с острым инсультом и другими тяжелыми воспалительными состояниями

Мочевая кислота представляет собой метаболит, сывороточная концентрация которой и роль при церебральной ишемии трактуются неоднозначно, что формирует «парадокс мочевой кислоты». С одной стороны, хроническая гиперурикемия является установленным фактором риска сердечно-сосудистых событий, включая инсульт. Этот долгосрочный риск традиционно связывают с двумя основными механизмами: снижением почечной экскреции мочевой кислоты (наиболее частая причина) или увеличением её продукции (например, при пуриновой нагрузке). Почки играют центральную роль в гомеостазе мочевой кислоты, обеспечивая ее выведение путем клубочковой фильтрации и последующей канальцевой секреции; нарушение этой функции — ключевой фактор устойчивой гиперурикемии. С другой стороны, в контексте острой церебральной ишемии данные о мочевой кислоте связывают с маркером компенсаторной активности. В рамках нашего эксперимента, где функция почек была стабильной и контролировалась по динамике классических маркеров, наблюдаемый значимый прирост концентрации мочевой кислоты в плазме (до 120% через 2 ч и 150% через 24 ч после реперфузии) следует интерпретировать не как следствие её задержки, а как результат активного увеличения локальной продукции. Данный биохимический сдвиг, таким образом, отражает не почечную дисфункцию, а активацию эндогенной антиоксидантной системы в ответ на ишемию. Мочевая кислота, синтезируемая эндотелием сосудов головного мозга, выполняет в нейроваскулярной единице прямую нейропротективную функцию, ограничивая токсическое действие пероксинитрита и других активных форм кислорода. Таким образом, полученные данные об остром повышении мочевой кислоты в модели церебральной ишемии, при сохранной функции почек, позволяют говорить об адаптивном ответе — усилении локальной продукции мочевой кислоты с целью антиоксидантной защиты. Это подчеркивает необходимость дальнейшей контекстуальной оценки уровня мочевой кислоты как потенциального маркера активности компенсаторных систем в остром периоде инсульта

Полученные результаты подтверждают наличие взаимосвязи между непрямыми показателями мозгового кровотока, оцененного по гемодинамике конъюнктивы, и биохимическими маркерами, отражающими метаболическую (альбумин) и цитолитическую (АЛТ) функцию печени. Это свидетельствует о комплексном характере ответа организма на церебральную ишемию, затрагивающем как системную гемодинамику, так и функцию печени. Выявленные корреляции подтверждают потенциальную информативность сочетания гемодинамических и биохимических методов для оценки тяжести ишемического поражения мозга. Корреляция между ранним снижением перфузии конъюнктивы (показатель М) и последующим повышением АЛТ свидетельствует о том, что изменения периферической микроциркуляции могут служить индикатором системности повреждения, а дисфункция печени является одним из значимых последствий церебральной ишемии. Повышение АЛТ в сочетании с гипоальбуминемией представляет собой лабораторное подтверждение тяжести системного ответа на инсульт.

Проведенный корреляционный анализ с использованием критерия Спирмена выявил ряд статистически значимых взаимосвязей между параметрами микроциркуляции и биохимическими маркерами, отражающими системный характер патологического процесса при церебральной ишемии. Наиболее выраженная отрицательная корреляция наблюдалась между систолическим артериальным давлением (SAP) и уровнем мочевой кислоты (ρ = -0,738; p < 0,001). Данная взаимосвязь демонстрирует сильную зависимость между показателями системной гемодинамики и метаболическими нарушениями, что может отражать компенсаторные механизмы регуляции сосудистого тонуса в условиях ишемии. Значимая положительная корреляция средней силы выявлена между параметром перфузии конъюнктивы (M) и уровнем мочевой кислоты (ρ = 0,636; p < 0,001). Этот результат свидетельствует о взаимосвязи между изменениями микроциркуляторного русла и активацией пуринового метаболизма, что согласуется с концепцией системного оксидативного стресса при ишемическом повреждении. Умеренные отрицательные корреляции установлены между перфузией конъюнктивы и систолическим артериальным давлением (ρ = -0,534; p = 0,001), а также между перфузией и уровнем альбумина (ρ = -0,490; p = 0,003). Полученные данные могут отражать сложные компенсаторные взаимоотношения между системной и микроциркуляторной гемодинамикой, а также участие печени в патологическом процессе. Выявлена значимая отрицательная корреляция между уровнем альбумина и мочевой кислоты (ρ = -0,558; p < 0,001), что указывает на взаимосвязь между синтетической функцией печени и метаболическими нарушениями. Одновременно обнаружена положительная корреляция между альбумином и уровнем железа (ρ = 0,532; p = 0,001), отражающая возможную роль железо-белкового метаболизма в патогенезе системного ответа на церебральную ишемию.

Таким образом, проведенный анализ подтверждает существование тесной функциональной взаимосвязи между головным мозгом, печенью и системой микроциркуляции в остром периоде ишемического инсульта. Полученные данные, согласующиеся с литературными указаниями на возможное высвобождение печеночных ферментов из церебрального эндотелия и их прогностическую роль, обосновывают концепцию церебро-печеночного синдрома как системного компонента ишемического поражения мозга. Это подчеркивает важность комплексного мониторинга не только неврологического статуса, но и биохимических маркеров повреждения печени для углубленного понимания патогенеза инсульта и потенциальных путей прогнозирования исхода заболевания.