РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ПОЛНОГО МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА СВИНЕЙ

Домашняя свинья (Sus scrofa domestic) является наиболее распространенным и экономически значимым видом сельскохозяйственных животных в России. По данным статистики Росстат

Племенная база свиноводства России на начало 2022 г. представлена 7 породами свиней с общей численностью основных и проверяемых свиноматок 122280 голов. При этом основной разводимой породой является крупная белая, удельный вес которой составляет 56,9%, далее следуют: йоркшир – 18,52%, ландрас – 18,18%, дюрок – 5,83%, на остальные породы – приходится 0,56%

Для эффективного ведения данной отрасли необходимо правильное и полное использование ее производственного потенциала, что становится невозможным без использования данных о генетических механизмах, происходящих в породах свиней, разводимых на территории России.

Всемирная Продовольственная и сельскохозяйственная организация ФАО считает основными трудностями в рациональном использовании пород сельскохозяйственных животных отсутствие полноценной информации об их генетической структуре

Для характеристики генетического разнообразия домашних животных и их диких сородичей, в частности домашних свиней и диких кабанов, на сегодняшний день используется множество маркеров, таких как микросателлиты (STR)

В то время как в России повсеместно проводятся работы по изучению генетического разнообразия домашних свиней, основанные на исследовании полиморфизмов ядерной ДНК (STR- и SNP-маркеры), митохондриальный геном остается без должного внимания. На сегодняшний день митохондриальная ДНК российских пород свиней исследуется только по единичным маркерам, таким как D-петля

В связи с вышеизложенным целью данной работы являлась разработка и валидация тест-системы анализа полиморфизма полных нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов свиней (Sus Scrofa).

В качестве биологического материала для исследования была использована ткань, полученная от свиней четырех трансграничных пород (n=17) и дикого кабана (n=3). Выборка свиней была представлена породами: крупная белая (n=10), йоркшир (n=4), дюрок (n=2) и ландрас (n=1). Выборка дикого кабана была представлена индивидуумами из Омской (n=2) и Тюменской (n=1) областей. Образцы ткани свиней и диких кабанов были получены из биоколлекции «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» (зарегистрирован Минобрнауки РФ № 498808), созданной и поддерживаемой в ФГБНУ ФИЦ животноводства – ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Исследование проводили на базе оборудования центра коллективного пользования «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. ДНК из ткани выделяли с использованием набора ДНК-Экстран-2 (ЗАО «Синтол», Россия) по стандартному протоколу производителя. Проверку качества и количества выделенной тотальной ДНК осуществляли в несколько этапов. Сначала, посредством горизонтального электрофореза в 1%-ом агарозном геле (U=110V, t=15 мин) определяли целостность полученной ДНК (рис. 1). Далее выполняли измерение концентрации и проверку чистоты, исследуемой ДНК на приборах Quibit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США) и NanoDrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, США) соответственно.

Рисунок 1 - Электрофореграмма проверки целостности, выделенной ДНК

DOI:10.23670/IRJ.2023.138.64.1

По результатам электрофореграммы были отобраны образцы № 1-3 (в области примерно в 16000 п.н. наблюдается фрагмент). Образец № 4 из-за отсутствия видимого фрагмента не амплифицируется при продолжительной ПЦР.

В соответствии с референсной последовательностью полного митохондриального генома свиней, представленной в базе Национального центра биотехнологической информации NCBI (GenBank: NC_000845.1) с помощью онлайн-ресурса Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) были подобраны праймеры для амплификации четырех перекрывающихся фрагментов мтДНК длиной от 4576 до 4857 п.о. (табл. 1).

ПЦР амплификацию проводили на термоциклере Applied Biosystems SimpliAmp («Thermo-Fisher Scientific, Inc.», США) в конечном объеме 25 мкл, в том числе 10 мкл реакционного буфера (2,5½ HF Reaction buffer), 10,25 мкл H2O, 2,5 мкл dNTPs, 1 мкл смеси праймеров, 0,25 мкл SmartTaq HF-FuZZ ДНК полимеразы («Диалат Лтд.», Россия), 1 мкл ДНК. Условия температурно-временного режима ПЦР были следующими: начальная денатурация (94 °С в течение 5 мин); 94 °С в течение 10 с, 63 °С в течение 15 с, 72 °С в течение 3 мин 30 с (33 цикла); заключительная элонгация (72 °С в течение 10 мин). Детекцию результатов ПЦР выполняли в 1 %-ном агарозном геле с использованием колориметрической системы документации на геле Uvitec FireReader V10 imaging System (Cleaver scientific, Великобритания) (рис. 2).

Рисунок 2 - Электрофореграмма 1% агарозного геля

Примечание: длина ампликона составляет от 4578 до 4857 п.о.

DOI:10.23670/IRJ.2023.138.64.3

Для исключения попадания в образец неспецифических фрагментов амплификации, полученные фрагменты мтДНК с помощью острого скальпеля вырезали из геля и проводили очистку, с использованием набора для очистки ДНК Cleanup S-Cap (Евроген, Россия).

Прочтение нуклеотидных последовательностей, полученных ампликонов мтДНК, проводили методом секвенирования нового поколения NGS (next generation sequencing) на приборе miSeq (Illumina, США). Создание библиотек для дальнейшего секвенирования полученных продуктов ПЦР проводили с использованием набора NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina согласно протоколу производителя. Для секвенирования подготовленных библиотек использовались наборы реагентов MiSeq Reagent Micro Kit, v2 (300 cycles) для прямого и обратного прочтения (Illumina, США).

Биоинформатическая обработка полученных ридов проводилась с использованием следующих программ: FastQC 0.11.9

С использованием программы DnaSP 6.12.01

Для определения принадлежности исследуемых образцов свиней и кабана к известным гаплогруппам, из базы NCBI были отобраны последовательности мтДНК свиней, относящиеся к гаплогруппам А, В, С, D и E (табл. 2).

Нами были получены нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов образцов свиней и дикого кабана (n=20) длиною 16611 п.н. Для расчетов параметров генетического разнообразия, исследуемые образцы были распределены на две группы: домашние свиньи и дикие кабаны (табл. 3). Наибольшее среднее число нуклеотидных различий было обнаружено у диких кабанов по сравнению с домашними свиньями: k=106,00 и k=90,985, соответственно. Кроме того, дикие кабаны характеризовались большим нуклеотидным разнообразием (π=0,00638) в сравнении с домашними свиньями (π=0,00548). При этом количество полиморфных сайтов было больше у домашних свиней по сравнению с дикими кабанами: S=237 и S=159, соответственно.

Всего было определено 16 гаплотипов, в том числе 13 у домашних свиней и 3 у диких кабанов. Все выявленные гаплотипы домашних свиней отличались от гаплотипов, обнаруженных у кабанов.

В породах свиней крупная белая и йоркшир, а также в группе диких кабанов были выявлены породоспецифичные гаплотипы. Один гаплотип (Hap-4) был общим для пород ландрас и дюрок (табл. 4).

Анализ филогенетического дерева (рис. 3), построенного методом ML (максимального правдоподобия) выявил, что гаплотипы домашних свиней Hap-5 и Hap-6 были соотнесены с представителями гаплогруппы A. Гаплотипы Hap-1, Hap-3, Hap-10 домашних свиней и гаплотип Hap-14 дикого кабана были определены с гаплогруппой B. С гаплогруппой C кластеризовались гаплотипы Hap-2, Hap-13, Hap-12 домашних свиней и гаплотип Hap-15 дикого кабана, а гаплотипы Hap-4, Hap-7, Hap-11 домашних свиней и гаплотип Hap-16 дикого кабана были распределены с гаплогруппой D, в то время как гаплотипы Hap-8 и Hap-9 были определены с представителями гаплогруппы E.

Представители домашних свиней характеризовались наличием всех гаплогрупп, в то время как дикие кабаны соотносились лишь к трем гаплогруппам. Кабаны, обитающие на территории Омской области (Hap-14, Hap-15), соответствовали гаплогруппам азиатского происхождения (гаплогруппы B и С), а кабан из Тюменской области характеризовался наличием гаплогруппы D (европейское происхождение).

Рисунок 3 - Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия

DOI:10.23670/IRJ.2023.138.64.7

Примечательно, что, несмотря на небольшую выборку животных, нами были определены все пять известных гаплогрупп, что позволяет сделать вывод об универсальности разработанной тест-системы.

Таким образом, разработанная нами тест-система, позволила получить полные митохондриальные геномы домашних свиней и дикого кабана. В результате нами были получены 20 последовательностей мтДНК длиной 16613 п.н., на основании которых, была дана характеристика материнской изменчивости и определена гаплогрупповая принадлежность исследуемых образцов к известным, на сегодняшний день, гаплогруппам рода Sus sсrofa A, B, C, D, и E.

Полученные в данной работе результаты исследований открывают перспективы дальнейшего проведения обширного секвенирования различных пород свиней и популяций кабана, обитающих на территории России, что позволит получить детальную информацию не только о состоянии генетического разнообразия, но и о древних эволюционных событиях и демографической истории представителей вида Sus scrofa.