Фармакогностическое изучение листьев ирги круглолистной (Amelanchier ovalis Medik) на наличие полисахаридов

Несмотря на то, что в настоящее время создаётся огромное количество синтетических лекарственных средств, достаточно эффективных при лечении многих заболеваний, значение растений как источника биологически активных веществ сохраняется. По данным Всемирной организации здравоохранения, 80% населения мира предпочитает традиционную медицину, использующую при лечении различных заболеваний определённые растения, естественная среда обитания которых с каждым годом неуклонно сокращается [1]. Считается, что в настоящее время 15 000 видов находятся под угрозой исчезновения [1]. В связи с этим большое значение имеет поиск растений, которые могли бы стать новыми источниками биологически активных веществ. Объектом наших исследований стала ирга круглолистная (Amelanchier ovalis Medik), семейство розоцветные (Rosaceae) – кустарник, выращиваемый во многих садах с целью получения плодов, а также для создания живых изгородей. Ирга распространена по всей территории РФ, встречается даже в Западной Сибири [2], [3]. В народной медицине при лечении ряда заболеваний применяются все части растения [3], [4]. Исследованиями, проведёнными ранее, было установлено, что водные и водно-спиртовые извлечения, полученные из листьев ирги, собранных как весной, так и осенью, обладают достаточно высокой антиоксидантной активностью [5].

Целью данной работы явилось выделение водорастворимых полисахаридов (ВРПС) и пектиновых веществ (ПВ) из листьев ирги круглолистной, установление их количественного и качественного состава, а также определение степени этерификации выделенного пектина.

Объект исследования – листья ирги круглолистной заготавливались в ботаническом саду Пятигорского медико-фармацевтического института весной (в мае) и осенью (в начале сентября) 2021 года. Собранные листья имели овальную форму, сверху голые, снизу беловатые и опушенные. Средняя длина – 4 см, средняя ширина 2,7 см. До постоянной массы листья высушивали теневой сушкой. Измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито, имеющего диаметр отверстий 5 мм (№ 5600). В основу получения полисахаридов был положен метод Кочеткова, позволяющий из одной порции сырья выделить наиболее важные полисахаридные комплексы – ВРПС и ПВ [6]. Для исследования использовали 100,0 грамм сырья. Водорастворимые полисахариды извлекали водой дистиллированной, сырьё настаивали при комнатной температуре в течение пяти суток. Из той же порции сырья смесью 0,5% водного раствора оксалата аммония и щавелевой кислоты (1:1) экстрагировали ПВ. Экстракцию проводили в течение 1-го часа при 100ᵒС. И водорастворимые полисахариды и пектиновые вещества осаждали из растворов 96%-ным спиртом этиловым. Моносахаридный состав выделенных полисахаридных комплексов устанавливали после кислотного гидролиза 2н кислотой серной. Гидролиз проводили в колбе с обратным холодильником при 100ᵒС. ВРПС гидролизовали 10 часов, а ПВ – в течение 48 часов. Моносахариды в гидролизатах идентифицировали методом хроматографии на бумаге (БХ) в системе бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Сравнивали с достоверными образцами свидетелей. Хроматограммы проявляли анилинфталатным реактивом.

Определение массовых долей свободных карбоксильных групп, а также метоксилированных карбоксильных групп в составе пектиновых веществ, показателей необходимых для установления степени его этерификации, проводили титриметрическим методом [7], [8], [9].

Использовали пектин, выделенный из весенних листьев.

Степень этерификации (метоксиэтерификации) пектина – это величина, которая соответствует отношению содержания этерифицированных карбоксильных групп к сумме свободных и этерифицированных карбоксильных групп, то есть к общему количеству карбоксильных групп (в процентах). Рассчитывают по формуле:

(1)

где: λ% - степень этерификации пектина;

Км – количество метоксилированных карбоксильных групп, (%);

Ко – общее количество карбоксильных групп, (%).

Общее количество карбоксильных групп (Ко) – это величина, являющаяся суммой количества метоксилированных карбоксильных групп (Км) и свободных карбоксильных групп (Кс) в %:

(2)

Массовую долю свободных карбоксильных групп (Кс) устанавливали методом титриметрического титрования. В соответствии с методикой, приведённой в литературе [7], [8] водный раствор исследуемого пектина (1 г – точная навеска) титровали 0,1 М раствором натрия гидроксида в присутствии индикатора Хинтона до неисчезающего в течение минуты красного окрашивания. Кс расcчитывали по формуле:

(3)

где а – количество 0,1 молярного раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование, мл, (1 мл 0,1 молярного раствора NaOH соответствует 0,0045 г COOH);

m – навеска пектина, г.

Далее в том же растворе определяли массовую долю этерифицированных групп Кэ. К нейтрализованной пробе добавляли точный объем (10 мл) натрия гидроксида (0,5 моль/л), а по истечению 2-х часов – точный объём (10 мл) раствора кислоты хлористоводородной (0,1 моль/л). Избыток кислоты титровали раствором натрия гидроксида (01 моль/л). Расчёт Кэ проводили по формуле 4:

(4)

где b – количество 0,1 молярного раствора натрия гидроксида, пошедшего на второе титрование, мл;

m – навеска пектина, г

Так как многие пектины содержат в своём составе не только метоксильные, но и ацетильные группы, также подвергающиеся гидролизу, проводили поправку на эти группы:

(5)

где Ац – количество ацетильных групп, %

Массовую долю ацетильных групп в пектиновом веществе определяли дистилляционным методом в соответствии с методикой, описанной в литературе [8]. Использовали прибор, состоящий из парообразователя, дистилляционной колбы, холодильника Либиха и приёмника. Сначала исследуемое вещество подвергали гидролизу. Точную навеску пектиновых веществ помещали (1 г) в мерную колбу на 50 мл, добавляли 25 мл 0,6%-ного раствора гидроксида натрия и оставляли на 7 часов. По окончанию указанного времени содержимое колбы доводили водой дистиллированной до метки. Полученный гидролизат – 20 мл, переносили в дистилляционную колбу и смешивали с равным объёмом раствора сульфата магния (100 г сульфата магния растворяли в воде дистиллированной до 180 мл и добавляли 1 мл концентрированной кислоты серной). Дистилляционную колбу нагревали до тех пор, пока объём раствора в ней не достигали 20 мл, после чего через колбу пропускали пар. В дистилляционной колбе постоянно поддерживали объём раствора 15 – 20 мл. Дистиллят объёмом 100 мл, содержащий уксусную кислоту, титровали раствором гидроксида натрия (0,1 моль/л) по фенолфталеину. Параллельно проводили такой же опыт с 20 мл раствора и 20 мл воды дистиллированной. Количество ацетильных групп рассчитывали по формуле 6:

(6)

где с – разность между количествами раствора гидроксида натрия (0,1 моль/л), пошедшего на титрование в опыте с навеской и без навески исследуемого вещества.

Процентное содержание метоксильных групп (СН3О) вычисляли по формуле 7:

(7)

где: Км – содержание метоксилированных карбоксильных групп в порошке пектина, %;

31 – эквивалентный вес СН3О- групп;

45 – эквивалентный вес СООН- групп.

Результаты по количественному содержанию ВРПС и ПВ приведены в таблице.

ВРПС – представляли собой аморфный порошок светло-коричневого цвета. Основные моносахариды, входящие в его состав – галактоза и ксилоза.

ПВ – светло-жёлтый аморфный порошок. Моносахаридный состав представлен галактуроновой кислотой и галактозой

Из данных таблицы следует, что листья ирги содержат небольшое количество как водорастворимых полисахаридов, так и пектиновых веществ. Причём осенние листья, собранные в начале сентября, по сравнению с листьями собранными в мае, содержат немного больше ВРПС и меньше ПВ, что в целом согласуется с результатами изучения динамики накопления полисахаридов для других растений [10].

Важной характеристикой пектиновых веществ является степень их этерификации. От этого показателя, например, зависят условия, в которых эти полисахариды образуют гели, а также их способность связывать в пищеварительном тракте тяжелые металлы [11].

Результаты, полученные при определении функциональных групп и степени этерификации исследуемого пектинового вещества, приведены в таблице 2.

Из представленных данных следует, что пектиновые вещества, выделенные из осенних листьев ирги круглолистной, имеют степень метоксилирования меньше 50%, следовательно, относится к низкоэтерифицированным.

В результате проведённых исследований установлено что:

1) листья ирги круглолистной собранные в весеннее и осеннее время – в мае и начале сентября содержат ВРПС и ПВ, которые не отличаются по своему качественному составу, но немного отличаются по количественному выходу этих веществ;

2) доминирующими моносахаридами ВРПС являются галактоза и ксилоза, а доминирующими моносахаридами ПВ – галактуроновая кислота и галактоза.

3) степень метоксилирования пектиновых веществ, выделенных из весенних листьев, составляет 41,14 %, то есть по современной классификации относятся к низкоэтерифицированным (LM) пектинам.