ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ КИСЛЫХ ФОСФАТАЗ АМАРАНТА

Иваченко Л.Е.¹, Трофимцова И.А.², Чернышук Д.К. ³

¹Доктор биологических наук, профессор кафедры химии, ²Кандидат химических наук, профессор кафедры химии, ³ORCID: 0000-0002-5342-4857, Аспирант кафедры химии, Благовещенский государственный педагогический университет, г. Благовещенск

Исследования выполнены в рамках финансирования НИР № 343 Госзадания Министерства образования и науки Российской Федерации

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ КИСЛЫХ ФОСФАТАЗ АМАРАНТА

Аннотация

Изучена динамика изменения удельной активности и множественных форм кислых фосфатаз семян амаранта, полученных в разные вегетационные периоды. Установлено, что максимальная активность фермента наблюдалась в 2014 году, когда погодные условия региона соответствовали среднемноголетним значениям. При проращивании семян амаранта в растворе сульфата цинка (С = 56 мг/л) на ранней стадии онтогенеза наблюдается значительное падение удельной активности фермента, что свидетельствует о высокой токсичности соли в данной концентрации. Выявлены множественные формы кислых фосфатаз проростков амаранта (Rf=0,48 и Rf=0,75), адаптивные к действию сульфата цинка.

Ключевые слова: амарант, кислая фосфатаза, удельная активность, множественные формы, тяжелые металлы, погодные условия.

Ivachenko L.E.¹, Trofimtsova I.A.², Chernyshuk D.K.³

¹PhD in Biology, Professor, Department of Chemistry, ²PhD in Chemistry, Professor, Department of Chemistry, ³Postgraduate student, Department of chemistry, Blagoveshchensk State Pedagogical University, Blagoveshchensk

INFLUENCE OF CONDITIONS OF CULTIVATION ON THE ACTIVITY OF ACID PHOSPHATASE AMARANTH

Abstract

The dynamics of change in the specific activity and the multiple forms of acid phosphatases amaranth seeds obtained in the different growing seasons. It was found that the highest enzyme activity was observed in 2014, when the weather conditions in the region consistent with long-term averages. When amaranth seed germination in a solution of zinc sulphate (C = 56 mg / L) in the early stages of ontogenesis there is a significant drop in the specific activity of the enzyme, indicating that the toxicity of high salt concentrations in the art. Identified multiple forms of acid phosphatases seedlings amaranth (Rf = 0,48 and Rf = 0,75), responsive to the action of zinc sulfate.

Keywords: amaranth, acid phosphatase, specific activity, multiple forms, heavy metals, weather conditions.

Проблемы интродукции овощных растений с высоким содержанием белка, незаменимых аминокислот и биологически активных веществ (БАВ) актуальны во всем мире в связи с недостатком этих соединений в рационе питания населения многих стран [4].

Растение амарант относится к числу культур, которые отличаются высоким содержанием белка, а также высокими адаптационными свойствами и большой продуктивностью биомассы, приспособленной к произрастанию практически по всей территории России [3].

В связи с ухудшением состояния окружающей среды актуальными на сегодняшний день являются исследования окислительного стресса  сельскохозяйственных культур на повышенные концентрации тяжелых металлов (ТМ) в почвах [7]. Ганс Селье разделял стрессовую реакцию организма на три стадии («триада Селье»): первичную индуктивную стрессовую реакцию, адаптацию (резистентность) и истощение ресурсов надёжности. На период третьей фазы защитные возможности растения исчерпываются, клеточные структуры (хлоропласты и митохондрии) разрушаются и вызывают энергетическое истощение клетки, что приводит к физико-химическим изменениям цитоплазмы. Как правило, это необратимый процесс и дальнейшее воздействие приведет к гибели растения [6].

Проблема адаптации организма к изменяющимся условиям среды на уровне биохимических реакций приобрела в последние годы фундаментальный характер. Особым вниманием в настоящее время пользуется феномен неспецифической адаптации, включающий биохимические процессы, которые происходят в клетке вне зависимости от того, какой стрессовый фактор их вызвал (неспецифический адаптационный синдром) и, вместе с тем, позволяют живому организму сохранять гомеостаз. Ведущую роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза и адаптации к стрессорам играют ферменты [2].

Фосфатазы относятся к классу гидролаз, это ферменты катализирующие гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты. Функция фосфатаз в организме состоит в поддержании концентрации фосфата, необходимого для различных биохимических процессов, и, возможно, для транспорта фосфата в клетку[1].

Цель исследования – изучить влияние условий выращивания амаранта сорта Крепыш на активность кислой фосфатазы семян и проростков.

Материалом для исследований служили семена овощного амаранта сорта Крепыш (Amaranthus hypochondriacus L.), выращенные в 2012, 2013, 2014 годах на агробиостанции ФГБОУ ВО «БГПУ». Метеорологические условия в южной зоне Амурской области в эти годы характеризовались значительными отклонениями от среднемноголетних показателей (табл. 1). В 2012 году весь период вегетации амаранта стояла очень жаркая погода (на 1-2 ^оС выше нормы), особенно на ранней стадии онтогенеза. 2013 год оказался сложным как по температуре, так и по осадкам. Самым жарким в этом году оказался май, со средней температурой на 2 ^оС выше нормы. Обильные осадки в июле и августе (на 70 % выше нормы) привели к переувлажнению почвы и большому наводнению в нашем регионе. Вегетационный период 2014 года был более благоприятным для роста и развития амаранта. Температурные условия соответствовали среднемноголетним значениям региона, только в мае температура была ниже нормы на 2 ^оС. Существенное влияние на рост и развитие амаранта в 2014 году оказали осадки. После наводнения 2013 года и при достаточной влаге в 2014 году были отмечены дружные всходы амаранта.

 Таблица 1 – Метеорологические условия Амурской области в 2012-2014 гг.

Месяцы	Среднемноголетняя	2012	2013	2014
Средняя температура воздуха, °С
V	12,4	14,2	14,5	10
VI	18,8	21,4	19,7	19
VII	21,5	22,6	21,7	22
VIII	19,2	20,2	19,8	18
IX	12,2	13,2	13,1	14
Среднее	16,8	18,3	17,8	16,6
Сумма осадков, мм
V	39	21	78,7	114
VI	85	61	61,3	112
VII	106	208	184,9	84
VIII	103	43	243,4	119
IX	66	131	54,9	58
Среднее	399	464	623,2	487

 

Для изучения устойчивости амаранта к ТМ семена проращивали в растворе сульфата цинка (С = 56 мг/л) в чашках Петри в термостате при 25 °С в течение 7 суток. Контролем служили семена амаранта, обработанные дистиллированной водой.

Активность кислых фосфатаз (КФ 3.1.3.2) определяли спектрофотометрически с п-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата. Фракционирование кислых фосфатаз (КФ) вели методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Дэвису с последующим окрашиванием гелевых блоков α-нафтилфосфатом, путем последовательного азосочетания с прочным синим Б [5]. Статистическую обработку материала и расчет коэффициентов корреляций проводили по методу Плохинского [8].

Первым этапом работы стало исследование активности КФ семян амаранта в течение трех лет (рис. 1).

В ходе исследований было показано, что в 2012 году, при выращивании амаранта в условиях жаркого лета, активность КФ в семенах была самой низкой. В 2014 году, когда погодные условия соответствовали среднемноголетним, выявлена высокая активность фермента. В семенах амаранта, полученных в 2014 году, обнаружена удельная активность кислой фосфатазы в 5 раз выше, чем в 2012 году (рис. 1А).

Рис. 1 А – удельная активность кислых фосфатаз семян амаранта; Б – схемы энзимограмм кислых фосфатаз семян амаранта; I – 2012г, II – 2013г, III – 2014г. Стрелка – направление электрофореза (от катода к аноду)

 

Летнее наводнение 2013 года, охватившее огромные территории российского Дальнего Востока и северо-востока Китая губительно повлияло на почву и урожай сельскохозяйственных культур. Наводнения приводят к изменению структуры почвы, вымыванию значительного количества полезных веществ, необходимых для растений, и повышенной влажности. Все эти факторы могут оказаться губительными для урожая. Но, исходя из полученных данных, семена амаранта сорта Крепыш, полученные в условиях высокой влажности воздуха и переувлажнения почвы, обладали повышенной удельной активностью фермента - в 2 раза выше по сравнению с 2012 годом и большим числом множественных форм.

Анализ энзимограмм позволил выявить шесть форм КФ. В зависимости от погодных условий выявлено от двух до четырех форм фермента (рис. 1Б).

Таким образом, повышенная температура воздуха и переувлажнение почвы в период вегетации амаранта отрицательно влияют на биохимические процессы в растении. Анализ полученных результатов позволил установить корреляцию между удельной активностью и количеством множественных форм фермента.

На следующем этапе исследований изучена активность КФ при интоксикации семян амаранта сорта Крепыш урожая 2013 года сульфатом цинка (табл. 2).

 

Таблица 2 – Активность кислых фосфатаз семян амаранта сорта Крепыш при интоксикации сульфатом цинка (С = 56 мг/л)

Концентрация раствора соли ТМ и экспозиция опыта	Удельная активность фермента, ед/мг белка
Контроль, 1 сутки	0,136±0,001
ZnSO4, 1 сутки	0,149±0,001
Контроль, 3 суток	0,831±0,001
ZnSO4, 3 суток	0,543±0,002
Контроль, 5 суток	0,370±0,006
ZnSO4, 5 суток	0,453±0,022
Контроль, 7 суток	0,615±0,014
ZnSO4, 7 суток	0,514±0,024

 

Изучение удельной активности КФ семян амаранта, обработанных сульфатом цинка, показало, что на третьи сутки воздействия наблюдается значительное падение удельной активности фермента относительно контроля, что свидетельствует о высокой токсичности сульфата цинка в данной концентрации для проростков амаранта. Стадия адаптации (резистентности) длится короткий период и на седьмые сутки воздействия изучаемой соли удельная активность КФ вновь уменьшается относительно контроля, наступает третья фаза (истощение) (рис. 2).

Рис. 2 - Динамика изменения удельной активности кислых фосфатаз при интоксикации семян амаранта сорта Крепыш раствором сульфата цинка

 

Анализ электрофореграмм позволил установить, что количество множественных форм кислых фосфатаз в контроле не изменяется на ранней стадии онтогенеза. В опытных образцах количество множественных форм КФ не превышает двух в течение всего времени эксперимента, но меняется лишь их электрофоретическая подвижность: появляется новая форма с Rf=0,75 и исчезает форма с Rf=0,48. Следует отметить, что форма с Rf=0,64, обнаруженная в контроле, встречается при обработке семян раствором сульфата цинка на протяжении всего периода воздействия соли (рис. 3).

 

Рис. 3 - Схемы энзимограмм кислых фосфатаз при проращивании семян амаранта сорта Крепыш: 1,3,5,7 – продолжительность воздействия (сутки); I – в воде, II – в растворе сульфата цинка; Стрелка – направление электрофореза (от катода к аноду)

 

Установлена корреляция между удельной активностью и множественными формами кислых фосфатаз семян и проростков амаранта сорта Крепыш Отмечена наибольшая удельная активность и количество множественных форм фермента (четыре) в 2014 году, когда температура при выращивании амаранта соответствовала среднемноголетним значениям. Проращивание семян амаранта в растворе сульфата цинка изменяет активность кислых фосфатаз. Сульфат цинка в исследуемой концентрации оказывает угнетающее действие на проростки амаранта. При воздействии сульфата цинка (в зависимости от времени экспозиции) в проростках амаранта происходит не только изменение удельной активности кислых фосфатаз, но и изменяется набор множественных форм фермента. На 5-7 сутки исчезает форма кислой фосфатазы с Rf=0,48 и появляется форма с Rf=0,75, которая сохраняется в фазу истощения и была ранее выявлена при выращивании амаранта в 2012 году в условиях повышенной температуры (рис.1).

Список литературы / References

1. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. – М. : Иностранная литература, 1996. – 814 с.
2. Иваченко, Л.Е. Ферменты как маркеры адаптации сои к условиям выращивания: монография / Л.Е. Иваченко. – Благовещенск: Благовещенский государственный педагогический университет. – C. 21–32.
3. Кононков, П. Ф., Гинс, М. С., Гинс, В. К. Амарант – перспективная культура XXI века / П. Ф. Кононков, М. С. Гинс, В. К. Гинс // 2-е изд. – Москва, 1999. – 296 с.
4. Кононков, П. Ф., Пивоваров, В. Ф., Гинс, М. С., Гинс, В. К. Интродукция и селекция овощных культур для создания нового поколения продуктов функционального действия / П. Ф. Кононков, В. Ф. Пивоваров, М. С. Гинс, В. К. Гинс // М. : 2008. – 170 с.
5. Левитес, Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес. – Новосибирск: Наука, 1986. – 145 с.
6. Селье, Г. Очерки об адаптационном синдроме. Пер. с англ. – М.: Медицина, 1960. – 254 с.
7. Степанок, В.Б. Влияние сочетания соединений тяжелых металлов на урожай сельскохозяйственных культур и поступление тяжелых металлов в растениях / Агрохимия. – 2000. – № 1. – С. 74-80.
8. Плохинский, Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский // Учебное пособие. 2-е издание. – Москва: Издательство Московского университета, 1970. – 146 с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Dikson, M. Fermenty [Enzymes] / M. Dikson, Je. Ujebb. – M. : Inostrannaja literatura, 1996. – 814 s. [in Russian]
2. Ivachenko, L.E. Fermenty kak markery adaptacii soi k uslovijam vyrashhivanija [Enzymes like soybean markers adaptation to growing conditions] : monografija / L.E. Ivachenko. – Blagoveshhensk: Blagoveshhenskij gosudarstvennyj pedagogicheskij universitet. – S. 21–32. [in Russian]
3. Kononkov, P. F., Gins, M. S., Gins, V. K. Amarant – perspektivnaja kul'tura XXI veka [Amaranth - a promising culture of the XXI century] / P. F. Kononkov, M. S. Gins, V. K. Gins // 2-e izd. – Moskva, 1999. – 296 s. [in Russian]
4. Kononkov, P. F., Pivovarov, V. F., Gins, M. S., Gins, V. K. Introdukcija i selekcija ovoshhnyh kul'tur dlja sozdanija novogo pokolenija produktov funkcional'nogo dejstvija [Introduction and selection of vegetables to create a new generation of functional foods actions] / P. F. Kononkov, V. F. Pivovarov, M. S. Gins, V. K. Gins // M. : 2008. – 170 s. [in Russian]
5. Levites, E.V. Genetika izofermentov rastenij [Plant Genetics isoenzymes] / E.V. Levites. – Novosibirsk: Nauka, 1986. – 145 s. [in Russian]
6. Sel'e, G. Ocherki ob adaptacionnom sindrome [Essays about adaptation syndrome]. Per. s angl. – M.: Medicina, 1960. – 254 s. [in Russian]
7. Stepanok, V.B. Vlijanie sochetanija soedinenij tjazhelyh metallov na urozhaj sel'skohozjajstvennyh kul'tur i postuplenie tjazhelyh metallov v rastenijah [Effect of combinations of compounds of heavy metals on crop yields and heavy metals in plants] / Agrohimija. – 2000. – № 1. – S. 74-80. [in Russian]
8. Plohinskij, N.A. Biometrija [Biometrics] / N.A. Plohinskij // Uchebnoe posobie. 2-e izdanie. [Tutorial. 2nd edition.] – Moskva: Izdatel'stvo Moskovskogo universiteta, 1970. – 146 s. [in Russian]