РЕГУЛИРУЮЩАЯ РОЛЬ КРИОПРОТЕКТОРОВ И АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ХРАНЕНИИ ГЕНОПЛАЗМЫ ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР

Вержук В.Г.¹, Павлов А.В.², Мурашев С.В.³, Дзюбенко Н.И.⁴, Тихонова О.А.⁵, Орлова С.Ю.⁶, Новикова Л.Ю.⁷, Шубин Н.А.⁸

¹Кандидат биологических наук, Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И.Вавилова, Санкт-Петербург, ²Младший научный сотрудник, Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И.Вавилова, Санкт-Петербург, ³Доктор технических наук, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, ⁴Доктор биологических наук, Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И.Вавилова, ^5,6Кандидат сельскохозяйственных наук, Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И.Вавилова, ⁷Кандидат технических наук, Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И.Вавилова, ⁸Главный инженер, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

РЕГУЛИРУЮЩАЯ РОЛЬ КРИОПРОТЕКТОРОВ И АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ХРАНЕНИИ ГЕНОПЛАЗМЫ ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР

Аннотация

Проведены исследования по криосохранению черенков и почек в парах жидкого азота плодовых и ягодных культур, почки черемухи в отдельном опыте перед хранением были обработаны криопротекторами, различной концентрации. Определяли содержание витамина С в древесных растительных тканях и убыль массы урожая прихолодильном хранении.  Рост содержания органических кислот в древесной ткани растений, которое  определяли в декабре – мае, сопровождается уменьшением убыли массы урожая при холодильном хранении, полученного за период вегетации.  Результаты криохранения черенков в парах жидкого азота выявили, что все гибриды черной смородины после высадки в почву показали хорошую жизнеспособность(50,0%-80,0%).Обработанные криопротекторами,отделенные от древесины почки черемухи, показали различный процент жизнеспособности(54,8±13,7%) и более высокий процент был у почек, обработанных 40,0% сахарозой(80,0±6,4%).

Ключевые слова:плодовые культуры - черемуха, черная смородина, вегетативные побеги, почки, криоконсервация, криопротектор, генофонд.

Verzhuk V.G.¹, Pavlov A.V.², Murashev S.V.³, Dzyubenko N.I.⁴, Tikhonova O.A.⁵, Orlova S.Y.⁶, Novikova L.Y.⁷, Shubin N.A.⁸

¹PhD in Biology, N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, St. Petersburg, ²Associate Research Scientist, N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, St. Petersburg, ³PhD in Engineering, ITMO University, St. Petersburg, ⁴PhD in Biology, N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, St. Petersburg, ^5,6PhD in Agriculture, N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, St. Petersburg, ⁷PhD in Engineering, N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, St. Petersburg, ⁸Chief Engineer, Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg

THE REGULATING ROLE OF CRYOPROTECTANTS AND ANTIOXYDANTS DURING FRUIT AND BERRY PLANT GERMPLASM CONSERVATION

Abstract

Research was conducted on cryoconservation of cuttings and buds of cultivated fruit and berry plants in liquid nitrogen vapors. In a separate experiment, bird cherry buds were treated before conservation with cryoprotectants in various concentrations. Vitamin C content in woody plant tissues was measured as well as the loss in yield weight after freezer storage. The increase of organic acid content in woody plant tissue detected in December/May was accompanied by reduced losses in the weight of yield produced during the growing season following freezer storage. The results of cryoconservation of cuttings in liquid nitrogen vapors revealed that all hybrids of black currant after planting in the soil demonstrated good viability (50.0%‒80.0%). Bird cherry buds separated from wood after treatment with cryoprotectants showed various percentage of viability (54.8±13.7%), while higher percentage was identified in the buds treated with 40.0% sucrose solution (80.0±6.4%).

Keywords: large fruit –  bird cherry,ribes nigrum, vegetative shoots, buds, cryopreservation,   cryoprotectors, genofond.

В зимне-весенний период при низкой отрицательной температурепроисходит процесс постепенного обезвоживанияпротопластов плодовых растений, вследствие того, что свободная вода в межклетниках кристаллизуется и рост кристаллов в межклетниках происходит за счет свободной воды, поступающей из протопласта клеток[1, 2, 3]. В результате обезвоживания в протопласте растет концентрация электролитов, приводящая к денатурации белков, нарушению функций мембран и клеточных органелл. Одновременно усиливается окисление сульфгидрильных групп в белках, изменяющее их функциональные свойства.Потеря воды молекулами белков при обезвоживании стимулирует их сближение, агрегацию, потерю биохимических свойств и выпадение в осадок. Поэтому гидрофильные группы, включая сульфгидрильные, удерживая воду в гидратных оболочках, препятствуют сближению молекул белков, усиливая, таким образом, морозоустойчивость клеток растений. Здесь существует положительная связь между содержанием сульфгидрильных групп и морозоустойчивостью растений.Образование кристаллов льда в межклетниках растительных тканей вызывают нуклеаторы льда, а именно: полисахариды, белки, бактериальные клетки любой природы.  Постепенная дегидратация протопластов является одним из необходимых условий выживания растений при отрицательных температурах[2,4].Таким образом, внеклеточное образование льда –  важная возможность жизни растений в условиях отрицательных температур [4].Кроме того древесные растения в результате эволюции приобрели способность тормозить внутриклеточное образование кристаллов льда при низкой температуре,ой вследствие образования в протопластах высоких концентраций антинуклеаторов льда, протопласты при этом находятся в состоянии глубокого переохлаждения.

Согласно Конвенции по биоразнообразию, сохранение биологического разнообразия от исчезновения возможно двумя путями: in situ, т.е. в естественных условиях – лесах, полях, садах, и ex situ – в заповедниках, коллекционных садах и питомниках, различных генетических банках животных, рыб и т.д. (http://www.chd.int/).  Классический способ хранения плодовых культур путем посадки в садах дорогой и не обеспечивает 100% сохранность коллекционного материала. Однако существует альтернативная возможность длительного сохранения коллекций игенплазмы различных частей растений, при сверхнизких температурах методом криоконсервации, с последующим определением их жизнеспособности после длительного хранения в парах жидкого азота.

Для проведения криоконсервации генплазмы растений (плодовых, ягодных культур)при сверхнизких температурах (– 1850С) влияния природного количества антинуклеаторов недостаточно, необходимо понизить в клетках количество воды аккуратным подсушиванием растительной ткани при определенной отрицательной температуре до 30% остаточной влажности,что занимает несколько недель (метод Форслайна)(12).При криоконсервации объектов небольших размеров (растительных меристем, почек растений, яйцеклеток, сперматозоидов) для защиты клеток от действия сверхнизких температурприменяюткриопротекторы. Следует отметить, что криоконсервация в жидком азоте или его парах при – 183°С… – 185ºС, это перспективный и дешевый способ сохранения геноплазмы растений [9,10, 11]. При консервации также используют различные части растений – побеги(черенки), почки, пыльцу, меристемы и семена диких видов[12]. На примере черной смородины мы изучали способностьподсушенных при -50С черенков выдерживать сверхнизкие температуры при хранении их в парах жидкого азота, паралельнос этим были проведены исследования по хранению почек черемухи, обработанных перед замораживанием криопротекторами различной концентрации. Криозащитные вещества не только уменьшают размеры кристаллов льда в растительных тканях и их количество, но снижают токсические и другие вредные эффекты обезвоживания[13]. При закладке растительного материала на длительное хранение оценивали режимы замораживания-размораживания и условия вывода сохраняемой геноплазмы из состояния глубокого покоя.

Помимо длительного многолетнего хранения коллекционного материала при сверхнизких температурах, существует потребность в сезонном хранении плодов и ягод. Здесь применяются низкие положительные температуры, которые позволяют сохранить плоды свежими, без потери товарного качества.При таком типе хранения растительной продукции  окислительно-восстановительные процессы в растительных тканяхимеют большое значение, так как основные потери, связанные с жизнедеятельностью, происходят от процессов окисления в тканях плодов. Защиту плодов от избыточного образования активных форм кислорода осуществляют антиоксиданты и ферментные системы. Наиболее эффективными водорастворимыми антиоксидантами являются аскорбиновая кислота и глутатион, которые способны перехватывать различные кислородсодержащие радикалы и синглетный кислород, где антиоксидантное действие аскорбиновой кислоты и глутатиона реализуется в ферментном аскорбат-глутатионовом цикле.Положительной функцией витамина С и глутатиона является восстановление окисленных форм других низкомолекулярных антиоксидантов, например фенолов, которые могут окислятся радикалами или ферментативно. Окисление фенольных соединений сопровождается образованием хинонов, которые далее восстанавливаются аскорбатом и глутатионом. Данное восстановление обеспечивает детоксикацию продуктов окисления фенолов [4, 5]. В то же времябиохимический состав плодов и, следовательно, активность окислительно-восстановительных процессов в плодах в значительной степени зависят от состояния древесины плодовых деревьев в различные периоды вегетации. В результате появляется возможность раннего прогнозирования способности растительной продукции (плодов и ягод) к сезонному хранению в холодильниках при +1°С…+3°С с минимальными потерями[6,7,8]. В нашей работе мы исследовали возможности прогнозирования потерь плодово-ягодной продукции при хранении плодов в зависимости от состава древесины плодовых деревьев и наличия в ней антиоксидантов.

Криоконсервацию черенков и почек проводили на образцах черной смородины и черемухи, взятые в коллекционном саду филиала Павловской опытной станции ВИР им. Н.И. Вавилова (г. Павловск). Нарезали черенки смородины 8 гибридов европейского и сибирского подвидов Ribes nigrum L. в ноябре-декабре месяце, когда растения находились в состоянии глубокого покоя. Перед закладкой на хранение черенки с 2-3 почками подсушивали в шкафу «INCUBATOR – 818» при -4-5ºС до влажности 28-32%, затем замораживали в замораживателе фирмы «Sanyo Medikal Freeser» до – 48… – 50ºС и помещали на длительное хранение в пары азота. В работе с криопротекторами применяли проникающие в почки протекторы – 25% и 40% глицерин и 25% и 40% сахарозу. Почки инкубировали в криопротекторах 1ч при 20ºС, затем постепенно замораживали в замораживателе «Sanyo Medikal Freeser» до – 48… – 50ºС и помещали в пары азота на хранение. После 1,5-2 месяцев хранения в парах жидкого азотапочки размораживали, отмывали от протекторов и после проращивания на питательной среде(MS), определяли процент жизнеспособности.

Потери массы плодов во время холодильного хранения, связанные с жизнедеятельностью, определяли весовым методом, а их хранение проводили при температуре + 1°С… + 3ºС. Содержание органических кислот и аскорбиновой кислоты в плодах и древесной ткани растений(черенках) анализировали согласно принятым методикам в декабре – мае [14]. Исследования проводили в 3-х кратной повторности на таких плодовых культурах, как груша(сорт Чижовская), яблоня(сорт Белый налив), рябина(сорт Бурка и сорт Бусинка), жимолость(сорт Голубое веретено).

Лето 2012-2014гг было влажным,достаточное количество зимне-весенней влаги в почве в весенний период способствовало укоренению высаженных после хранения в парах азота черенков черной смородины, что положительно отразилось на росте растений – высота молодых побегов у  сильнорослых гибридов достигала 30 – 50см. В целом все опытные гибриды после посадки в почву прижились – процент приживаемости весной и в летний периоду них находился на уровне 70,0% - 80,0%, только у двух гибридов ПУ 18-5(Нарядная х №2) и Неосыпающаяся х№6 жизнеспособность черенков составляла 50,0%, 60,0% соответственно.

Почкичеремухи,обработанные криопротекторами различной концентрации, различались по жизнеспособности. У обработанных 25% раствором сахарозы почек сорта Августина процент жизнеспособных почек  составил72,0%, а при увеличении концентрации криопротектора до 40%,  процент жизнеспособных почек увеличился до 80,0%. После пересадки в большие стаканчики со средой почки хорошо развивались, формируя зеленые побеги. Обработка почек глицерином показала, что на 25%-й концентрации процент жизнеспособных почек составлял 54,8%, а на 40% концентрации процент жизнеспособных почек увеличился до 69,6%.Результаты обработки почек черемухи различными криопротекторами приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние криопротекторов на жизнеспособность почек черемухи сорта Августина после хранения в парах жидкого азота(- 183 - 185ºС)

Варианты применяемых криопротекторов	Количество почек черемухи, обработанных криопротекторами(всего и жизнеспособных после хранения в парах жидкого азота (-183… - 185ºС)		Жизнеспособность почек, %
	всего	жизнеспособных
25% раствор сахарозы	25	18	72,0±6,1
40% раствор сахарозы	25	20	80,0±6,4
25% раствор глицерина	29	20	54,8±13,7
40% раствор глицерина	26	19	69,6±7,8

 

Cтабильность ответной реакции почекпосле криохранения на обработку взятыми криопротекторами, позволяет сделать вывод о возможности применения их для долговременного хранения генплазмы растений. В зависимости от состава растительного материала, сортов, культур, можно подбирать различные криопротекторы, которые будут не-токсичные по своемухимическому составу, что, в конечном итоге, положительно повлияет на качество сохраняемого растительного материала.

В результате проведенных исследований по сезонному хранению плодов было установлено, что при увеличении витамина С в древесных тканях растений, которое определяли в декабре - мае, уменьшается естественная убыль массы урожая при холодильном хранении.  Аналогичная зависимость сохраняется для самих плодов и ягод – чем больше содержание витамина С в плодах на начальном этапе хранения, тем меньше величина естественной убыли массы плодов при хранении. Рост содержания органических кислот в древесной ткани растений, которые также определяли в декабре – мае, сопровождается уменьшением убыли массы урожая при холодильном хранении. При сохранении урожая плодов и ягод, наблюдалась аналогичная зависимость: чем больше содержание в них органических кислот на начальном этапе хранения, тем меньше величина естественной убыли массы плодов в дальнейшем хранении. Синхронный характер изменения зависимости убыли массы плодов и ягод при хранении от содержания витамина С и органических кислот обусловлен стабилизирующим влиянием органических кислот на аскорбиновую кислоту. Следовательно, исходя из сопоставления содержания витамина С и органических кислот в древесных тканях плодовых растений, определенных в зимнее - весенний период, т.е. задолго до сбора урожая, можно делать прогноз о способности плодовой продукции к холодильному хранению.

По результатам криохранения черенков в парах жидкого азота следует отметить, что все опытные гибриды черной смородины после хранения прижились и показали хорошую жизнеспособность. Обработанные криопротекторами почки черемухи после хранения в азоте и проращивания в стерильных условиях на питательной среде показали различный процент жизнеспособности, более высокий процент жизнеспособности у почек, обработанных 40,0% -ной сахарозой.  Увеличение содержания витамина С и органических кислот в растительных древесных тканях является следствием особенностей метаболитических процессов, протекающих в клетках растений. Рост восстановительного потенциала растительной ткани обеспечивает возможность растениям переносить неблагоприятные условия зимне-весеннего периода с меньшими повреждениями. Минимизация повреждений,возникающих в растительной ткани в зимне-весенний период создает необходимые предпосылки для роста продуктивности растений и формированию урожая, способного храниться более длительное время с меньшими потерями.

Список литературы / References

1. Туманов И.И. Физиология закаливания и зимостойкости растений. М.: Наука, 1979. 350 с.
2. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А., Физиология растений. М.: Высшая школа,2005.736 с.
3. Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс. М.: Наука, 2007. 60 с.
4. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.: Дрофа, 2010. 638 с.
5. Бобко А. Л., Мурашев С.В., Вержук В.Г. Влияние антиоксидантов в древесной ткани плодовых растений в зимнее-весенний период на холодильное хранение собранного урожая. Сборник научных работ// Низкотемпературные и пищевые технологии в XXIвеке. Санкт-Петербург, 2013. С. 381-383.
6. Бобко А.Л., Мурашев С.В., Вержук В.Г. Способ предварительного прогнозирования лежкости плодов и ягод при хранении. Патент РФ, № 2485759. Опубл. Бюл. 27.06.2013.
7. Мурашев С.В., Бобко А.Л., Вержук В.Г. Способ прогнозирования хранения плодово-ягодной продукции (варианты). Патент РФ, № 2485754. Опубл. Бюл. 27.06.2013.
8. Вержук В.Г.,Мурашев С.В., Бобко А.Л. Способ диагностики растительных тканей для раннего прогнозирования хранения плодов и ягод. Патент РФ, № 2486417. Опубл. Бюл. 20.06.2013.
9. Вержук В.Г., Павлов А.В., и др. Криоконсервация побегов и почек черемухи(PadusMill) cприменением различных криопротекторов и режимов замораживания. – Киев., 2011, С. 233-237.
10. Вержук В.Г., Павлов А.В., Тихонова О.А, Новикова Л.Ю. Жизнеспособность геноплазмы черной смородины(RibesnigrumL.), обработанной криопротекторами и без них после хранения в парах жидкого азота. – Киев., 2012. С. 417-421.
11. Вержук В.Г., Мурашев С.В., Тихонова Н.Г., Жестков А.С., Бобко А.Л., Дорохов Д.С. Влияние эндогенных веществ моно- и дисахаридов на жизнеспособность плодовых растений после хранения в парах жидкого азота. // Плодоводство и ягодоводство России. – М.: 2011, т. XXVI. – С. 17-23.
12. Forsline P. et al. Recovery and longevity of cryopreserved dormant apple buds // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1998. V. 123. № P. 365 – 370.
13. Попов А.С. Криоконсервация культивируемых клеток. Методы культивирования клеток. СПб., 2008. С. 236-250.
14. Ермаков А.И., и др. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. 430 с.

Список литературы на английском языке / References

1. Tumanov I.I. Fiziologija zakalivanija i zimostojkosti rastenij [Physiology of planthardening and winter-hardiness] / I.I. Tumanov. -Moscow: Nauka, 1979. - 350 p.[in Russian]
2. Kuznetsov V.V. Fiziologija rastenij [Plantphysiology] / V.V. Kuznetsov and G.A. Dmitrieva. - Moscow: Vysshaya Shkola, 2005. - 736 p. [in Russian]
3. Trunova T.I. Rastenie i nizkotemperaturnyj stress [Theplantandlow-temperaturestress]. / T.I. Trunova - Moscow: Nauka, 2007. - 60 p. [in Russian]
4. Koshkin E.I. Fiziologija ustojchivosti sel'skohozjajstvennyh kul'tur [Physiologyofcropresistance]. / E.I. Koshkin. - Moscow: Drofa, 2010. - 638 p. [in Russian]
5. Bobko A.L. Vlijanie antioksidantov v drevesnoj tkani plodovyh rastenij v zimnee-vesennij period na holodil'noe hranenie sobrannogo urozhaja. Sbornik nauchnyh rabot [The effect of antioxidant sinligneoustissueof fruit plants during the winter/spring season on cold storage of the harvest. Collectionofscientificpapers] / A.L. Bobko, S.V. Murashevand, V.G. Verzhuk. Low-temperature and food technologies in the 21st century. Petersburg, 2013. - P. 381–383. [in Russian]
6. Bobko A.L. Sposob predvaritel'nogo prognozirovanija lezhkosti plodov i jagod pri hranenii. Patent RF No. 2485759 [A method of early prognostication of the shelf life of fruits and berries during storage. RF Patent No. 2485759] / A.L. Bobko, S.V. Murashev and V.G. Verzhuk. - Published: Newsletter, 27.06.2013. [in Russian]
7. Murashev S.V. Sposob prognozirovanija hranenija plodovo-jagodnoj produkcii (varianty). Patent RF, № 2485 [A method of prognosticating the keeping quality of fruit and berry products (variants). RF Patent No. 2485754] / S.V. Murashev, A.L. Bobko and V.G. Verzhuk. - Published: Newsletter, 27.06.2013. [in Russian]
8. Verzhuk, V.G. Sposob diagnostiki rastitel'nyh tkanej dlja rannego prognozirovanija hranenija plodov i jagod. Patent RF, № 2486417 [A method of diagnosing plant tissues for early prognostication of fruit and berry keeping quality. RF Patent No. 2486417] / V.G. Verzhuk, S.V. Murashev and A.L. Bobko. - Published: Newsletter, 20.06.2013. [in Russian]
9. Verzhuk V.G. Kriokonservacija pobegov i pochek cheremuhi(PadusMill) cprimeneniem razlichnyh krioprotektorov i rezhimov zamorazhivanija [Cryoconservation of sprouts and buds of bird cherry (PadusMill) applying various cryoprotectants and freezing conditions] / V.G. Verzhuk, A.V. Pavlov et al. – Kiev, 2011. - P. 233–237. [in Russian]
10. Verzhuk V.G. Zhiznesposobnost' genoplazmy chernoj smorodiny(RibesnigrumL.)obrabotannoj krioprotektorami i bez nih posle hranenija v parah zhidkogo azota. [Viabilityofblackcurrant (Ribes nigrum) germplasm treated with cryoprotectants and without such treatment after storage in liquid nitrogen vapor] / V.G. Verzhuk, A.V. Pavlov, O.A. Tikhonova and L.Y. Novikova. – Kiev, 2012. - P. 417–421. [in Russian]
11. Verzhuk V.G. Vlijanie jendogennyh veshhestv mono- i disaharidov na zhiznesposobnost' plodovyh rastenij posle hranenija v parah zhidkogo azota [The effect of endogenous substances, monosaccharides and disaccharides on the viability of fruit plants after storage in liquid nitrogen vapor] / V.G. Verzhuk, S.V. Murashev, N.G. Tikhonova, A.S. Zhestkov, A.L. BobkoandD.S. Dorokhov. // Plodovodstvo i jagodovodstvo Rossii [Fruit and Berry Production in Russia]. - Moscow, 2011. Vol. XXVI. - P. 17–23. [in Russian]
12. Forsline P. et al. Recovery and longevity of cryopreserved dormant apple buds // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1998. V. 123. № 3. P. 365–370.
13. Popov A.S. Kriokonservacija kul'tiviruemyh kletok. Metody kul'tivirovanija kletok [Cryoconservation of cultivated cells. Cellcultivationmethods] / A.S. Popov - St. Petersburg, 2008. - P. 236–250. [in Russian]
14. Yermakov A.I. et al. Metody biohimicheskogo issledovanija rastenij [Methods of biochemical research on plants] / A.I. Yermakov et al. Leningrad: Agropromizdat, 1987. - 430 p. [in Russian]