ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А1 И CRF63_02A1

Щербакова Н.С.¹, Щербаков Д.Н.¹, Султанов Л.В.², Лукьянова В.А.², Новикова О.А.², Булатова Т.Н.³, Айкин С.С.³, Москалева Н.В.³, Конончук О.Н.³

¹ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область, ²КГБУЗ «Алтайский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», г. Барнаул, ³ГБУЗ КО «Кемеровский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», г. Кемерово

ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А1 И CRF63_02A1

Аннотация

Самая главная характеристика гуморального ответа на введение вакцины – нейтрализующая активность. В настоящее время широко используется метод нейтрализации env-псевдовирусов ВИЧ-1 с применением клеток TZM-bl. Поэтому cоздание и характеризация панелей псевдовирусов разных субтипов ВИЧ-1 является актуальной задачей.

Из сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов был амплифицирован полноразмерный ген envelope. Были сконструированы плазмиды pEnv и получены функциональные псевдовирусы. При помощи филогенетического анализа было показано, что 6 из полученных псевдовирусов относятся к CRF63_02A1 и 2 – к субтипу А1.

Таким образом, были получены 8 env-псевдовирусов ВИЧ-1 субтипов, распространенных на территории Западной Сибири.

Ключевые слова: ВИЧ-1, env-псевдовирусы ВИЧ-1, нейтрализация, TZM-bl.

Shcherbakova N.S.¹, Shcherbakov D.N.¹, Sultanov L.V.², Lukyanova V.A.², Novikova O.A.², Bulatova T.N.³, Aykin С.С.³, Moskaleva N.V.³, Konchuk О.N.³

¹SRC VB “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region, ²RSBH «Altay Regional Center for Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases», Barnaul, ³SBHA KR «Kemerovo Regional Center for Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases», Kemerovo

ENV-PSEUDOVIRUSES OF HIV-1 SUBTYPE A1 AND CRF63_02A1

Abstract

Neutralizing activity is the most important feature of humoral response. Nowadays method of neutralization of env-pseudoviruses of HIV-1 using TZM-bl cells is widely used. So, creation and characterization of env-pseudoviruses panels of different subtypes is important goal.

Full envelope gene was amplified from HIV+ serum. Plasmids pEnv were constructed and functional pseudoviruses were received. Using phylogenetic analysis, it was shown that 6 pseudovirus belong to CRF63_02A1 and 2 to subtype A1.

Thus, 8 env-pseudoviruses of HIV-1 subtype prevalent in Western Siberia were created.

Keywords: HIV-1, env-pseudoviruses of HIV-1, neutralization, TZM-bl.

В ответ на попадание в организм чужеродных антигенов, организм отвечает выработкой антител, нейтрализующих их активность. Аналогично, в ответ на введение вакцины в организме вырабатываются антитела, обладающие нейтрализующей активностью. Для оценки эффективности вакцины, необходим метод, адекватно и чувствительно анализирующий in vitro наличие или отсутствие нейтрализующих антител.

Существует множество подходов для оценки вируснейтрализующих свойств сывороток, они отличаются по типам используемых клеток и вирусов, по методам детекции результата и по тому, сколько раундов инфекции используется: один или множество [1]. В настоящее время широко применяется псевдовирусная система оценки нейтрализующих свойств сыворотки с использованием генетически-инженерных клеток TZM-bl [2]. TZM-bl (JC53BL-13) – генетически модифицированн клеточную линию HeLa, которая презентирует на своей поверхности большое число рецепторов ВИЧ-1 (CD4, CCR5, CXCR4) и содержит репортерные гены люциферазы светлячка и β-галактазидазы под контролем Tat-индуцируемого промотора [2].  При заражении клеток TZM-bl псевдовирусами, белок Tat ВИЧ-1 индуцирует ген люциферазы светлячка (Luc) и клетки испускают люминисценцию. По уровню люминисценции можно судить об инфицировании клеток.

Псевдотипированные вирусы – это рекомбинантные вирусные частицы, которые физиологически практически идентичны природным ВИЧ-1, но биологически безопасны. Благодаря наличию комплекса поверхностных гликопротеинов gp120-gp41 они способны однократно инфицировать клетки, несущие рецепторы CD4+ и CCR5/X4, но из-за дефектного генома не способны к дальнейшему размножению. Благодаря такой особенности псевдовирусы называют вирусами одного цикла инфекции и работа с ними безопаснее для исследователя. Env-псевдотированная вирусная система чувствительна, воспроизводима, обладает корреляционностью, она может быть оптимизирована и валидирована под стандарты GLP, GMP, GCLP для проведения клинических испытаний на людях, все реагенты могут быть стандартизованы, и, наконец, метод и все реагенты можно передавать между лабораториями и воспроизводить результаты.

Плазмидные env клоны стабильны, хорошо охарактеризованы, у них известна нуклеотидная последовательность, они могут быть легко и быстро переданы из лаборатории в лабораторию. Использование env-экспрессирующих плазмид для производства Env-псевдотипированных вирусов гарантирует, что в любое время в лаборатории может быть произведено достаточное количество псевдовирусов с определенным генотипом. Использование в исследованиях определенной панели псевдовирусов снижает время для проведения анализа и позволяет валидировать метод.

Задачей нашего исследования было получить панель псевдовирусов субтипов A1 и CRF63_02A1, распространенных в Западной Сибири.

Для этого, были взяты 10 сывороток ВИЧ-инфцированных из ГБУЗ «Кемеровский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» и 10 сывороток от Алтайского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. Из сывороток была выделена мРНК ВИЧ-1. Для получения кДНК с мРНК была проведена полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей гнездовой ПЦР на полноразмерный ген envelope. Амплифицированные фрагменты полноразмерного гена env были очищены из агарозного геля при помощи набора MinElute CEL Extraction kit (Qiagen), согласно инструкции, и клонированы в составе векторной плазмиды pcDNA™3.1/V5-HisTOPO®TA (Invitogen). Полученными рекомбинантными плазмидами pEnv были трансформированы компетентные клетки E.coli Stbl2. Отбор клонов, содержащих вставку, проводили методом ПЦР. Отобранные клоны, несущие вставку, нарабатывались в культуре клеток E.coli Stbl2. Выделение и очистку плазмид проводили на наборе QIAprep® Miniprep (Qiagen). Выход плазмид обычно составлял 300-500 нг/мкл. Последовательность гена env подтверждали секвенированием.

Псевдовирусы получали магнитной ко-трансфекцией (MATra, PromoKine) эукаратиотических клеток 293Т двумя видами плазмид в эквимолярных концентрациях: полученной нами pEnv-CRF63_02A1, кодирующей оболочечные белки ВИЧ-1, и pSG3Δenv (backbone-плазмида), кодирующей остальные белки ВИЧ-1, за исключением Env. В качестве контроля эффективности ко-трансфекции была проведена параллельная трансфекция клеток плазмидой, содержащей ген белка GFP. Клетки культивировали в 24-луночных планшетах в ростовой среде DMEM, содержащей 10% сыворотку плодов коровы, 600 мкг/мл глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Через сутки эффективность трансфекции определяли по площади флюоресценции в контрольных лунках, псевдовирусы концетировали путем смены ростовой среды в объеме 50% от исходного количества. Через 48 часов после ко-трансфекции собирали супернатант, содержащий псевдовирусы, и центрифугировали в микро пробирках 10 мин при 1000 об/мин для осаждения клеточного дебриса. 200 мкл супернатанта каждого псевдовируса оставляли для последующего определения функциональной активности псевдовирусов, а остальное количество аликвотили и хранили при -80°С.

Функциональную активность псевдовирусов определяли в клетках TZM-bl. 50 мкл псевдовирус-содержащего супернатанта вносили в лунку 96-луночного культурального планшета к монослою клеток. Для каждого псевдовируса анализ проводили в четырех повторах. Через 48 часов определяли функциональность псевдовирусов (способность заражать клетки) по уровню люминисценции. Люциферазную активность определяли при помощи реагента Luciferase Assay Reagent (Promega). Для этого после удаления ростовой среды с клеток, их однократно промывали PBS и лизировали при помощи Luciferase Cell Culture Lysis buffer (Promega). 10 мкл лизата переносили в оптические планшеты и добавляли по 50 мкл Luciferase Assay Reagent в каждую лунку. Уровень люминисценции измеряли на приборе Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) в течение 10 сек на каждую лунку. Клоны псевдовирусов отбирались как функциональные и пригодные для анализа нейтрализации при уровне люминисценции превышающей пороговый сигнал, как минимум, в 50 раз.

Для определения субтипа вируса, проводили построение филогенетических деревьев методом максимального правдоподобия при помощи программы RAxML. В качестве референс-последовательностей использовали ранее охарактеризованные последовательности субтипов и групп ВИЧ-1. Рекомбинацию изучали, используя программу SimPlot версия 3.5 с интервалом в 200 п.н. с построением филогенетического дерева методом присоединения соседей (двух-параметрная модель Кимуры). Достоверность филогенетических отношений определяли методом бутстреп-анализа.

Было определено, что 6 полученных нами псевдовирусов относятся к рекомбинантной формы CRF63_02A1, а 2 – к субтипу А1, которые широко распространены на территории Западной Сибири.

Таким образом, в результате работы нами были получены 8 env-псевдовирусов ВИЧ-1 субтипов, распространенных на территории СФО. Данные псевдовирусы можно использовать при исследовании антиретровирусных препаратов и вируснейтрализующих свойств сывороток.

Работа была выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-34-00338 мол_а.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Fenyö E.M., Heath A., Dispinseri S., Holmes H., Lusso P., Zolla-Pazner S., Alcami J., Scarlatti G. International network for comparison of HIV neutralization assays: The NeutNet report. // PloS one. – 2009. V. 4(2). P. e4505.
2. Montefiori D. Measuring HIV Neutralization in a Luciferase Reporter Gene Assay. – NY.: Humana Press, 2009. – P. 395-405.