Гистологическая оценка токсичности экстракта Phlojodicarpus sibiricus на печень и почки мышей линии ICR
Гистологическая оценка токсичности экстракта Phlojodicarpus sibiricus на печень и почки мышей линии ICR
Аннотация
В статье рассматривается влияние экстракта (лат. Phlojodicarpus sibiricus) на морфологические изменения в органах белых лабораторных мышей линии ICR, в частности, в печени и почках. Эксперимент был выполнен на 25 мышах, разделённых на пять групп в зависимости от дозы экстракта (10 мг/мл и 100 мг/мл) и продолжительности его введения (7 и 14 дней). Результаты показывают дозозависимое влияние экстракта на ткани органов с более выраженными изменениями при длительном воздействии и высоких дозах. Гистологический анализ выявил, что краткосрочное введение экстракта в низких и высоких дозах не вызывает значительных токсических эффектов на почки, в то время как длительное применение, особенно в высокой дозе, приводит к выраженным дистрофическим изменениям и некрозу гепатоцитов в печени.
1. Введение
В последние десятилетия все большее внимание ученых привлекают природные соединения, которые могут оказывать воздействие на иммунную систему. Это связано с необходимостью разработки новых средств для коррекции иммунного статуса, особенно в условиях возрастающей заболеваемости инфекционными и онкологическими заболеваниями, а также роста числа аллергических и аутоиммунных расстройств. Одним из перспективных направлений в этой области является изучение лекарственных растений и их экстрактов, обладающих иммуностимулирующими или иммуномодулирующими свойствами. Эксперименты на животных моделях показывают, что многие природные соединения могут вызывать как позитивные, так и негативные изменения в органах. Например, исследования на моделях гепатотоксичности демонстрируют, что высокие дозы некоторых фитопрепаратов могут приводить к структурным изменениям в печени, включая дистрофические процессы, некрозы гепатоцитов и воспалительные реакции в тканях. Эти изменения являются важными критериями для оценки потенциальной токсичности препарата и требуют тщательного анализа в экспериментальных исследованиях .
Одним из таких растений является вздутоплодник сибирский (лат. Phlojodicarpus sibiricus), который принадлежит к семейству сельдерейных и распространен в северных регионах Сибири и Монголии
. Это редкое растение известно своими уникальными свойствами и активно используется в народной медицине. В историческом контексте Phlojodicarpus sibiricus применялся для лечения различных заболеваний, включая туберкулез, заболевания желудочно-кишечного тракта, ожирение, а также онкологические патологии. Однако научные исследования, подтверждающие его токсическое действие на органы и системы органов, остаются ограниченными, что делает его изучение особенно актуальным .Биологически активные соединения растительных экстрактов могут оказывать влияние на клетки различных органов через активацию или подавление клеточных сигнальных путей. Флавоноиды и алкалоиды, присутствующие во Phlojodicarpus sibiricus, могут индуцировать изменения в тканях, такие как пролиферация клеток, воспалительные процессы и нарушение метаболизма, что приводит к дистрофическим изменениям и некрозам
. Эти процессы особенно выражены при длительном воздействии экстрактов или их применении в высоких дозах. Исследования показывают, что токсичность может проявляться через дозозависимый эффект, когда высокие дозы растительных препаратов вызывают морфологические изменения в органах, таких как печень, почки и селезенка .Токсическое действие лекарственных растений, таких как экстракт Phlojodicarpus sibiricus, на органы может происходить через структурные изменения клеток и тканей в зависимости от дозировки и продолжительности воздействия. Биологически активные соединения, содержащиеся в экстракте, такие как флавоноиды и алкалоиды, могут оказывать как терапевтическое, так и токсическое воздействие на клетки печени и почек. В случае применения высоких доз экстракта возможно развитие цитотоксических эффектов, к которым относятся дистрофические изменения и некроз клеток
.Механизмы токсичности экстракта Phlojodicarpus sibiricus перехода с его особенностью окислительный стресс и нарушать метаболизм клеток. Флавоноиды и алкалоиды, содержащиеся в экстракте, могут накапливаться в клетках печени и почек, приводя к их повреждению и дисфункции
. Продолжительное воздействие высоких доз может вызвать кумуляцию активных веществ в тканях, что приводит к их повреждению и нарушению архитектоники тканей .В результате исследований на моделях животных установлено, что длительное введение высоких доз растительных экстрактов, таких как экстракт Phlojodicarpus sibiricus, может вызвать воспалительные процессы, дистрофию и некроз клеток и почек
. Эти изменения особенно выражены при длительном воздействии, что указывает на необходимость осторожного применения экстракта в высоких дозах . Важным аспектом является установление безопасных дозировок экстракта для предотвращения возможных патологических изменений в органах .Таким образом, изучение морфологических изменений в печени и почках под воздействием экстракта Phlojodicarpus sibiricus имеет большое значение для оценки его безопасности. Необходимо учитывать дозозависимый эффект экстракта, который проявляется в виде повреждения клеток и тканей при высоких дозировках и длительном применении. Это требует проведения исследований для определения оптимальных доз и оценок терапевтических препаратов
. Несмотря на многие исследования по эффективности и токсичности данного растения, наше исследование сосредоточено на морфологических изменениях в гистоструктурах печени и почек под влиянием экстракта, что является важным аспектом для оценки биобезопасности.Цель исследования – на основе гистологического анализа печени и почек белых лабораторных мышей линии ICR оценить токсическое влияние экстракта Phlojodicarpus sibiricus при пероральном введении в зависимости от дозы и продолжительности его перорального введения.
2. Методы и принципы исследования
Для выполнения подставленной цели нами было проведено экспериментальное исследование на белых лабораторных мышах линии ICR, которые наиболее чаще используются в качестве объектов исследования. Апробация экспериментальной работы и его протокол одобрен локальным этическим комитетом СВФУ (протокол № 32 от 8.12.2021г. решение № 6). Эксперимент был проведен на 25 самцах в возрасте от 4-5 недель с массой от 22 до 25 гр, которые были разделены на 5 групп сравнения (по 5 мышей в группе). При этом 1 группа – мыши, которым вводили перорально 10 мг/мл в течение 7 дней; 2 группа – мыши получавшие 100 мг/мл в течение 7 дней, 3 группа – мыши получавшие 10 мг/мл в течение 14 дней, 4 группа – мыши получавшие 100 мг/мл в течение 14 дней и контрольная группа – без введения экстракта.
Для экстрагирования использовали надземную часть (стебли, листья, цветки) Phlojodicarpus sibiricus, которую собирали в период цветения в Ботаническом саду ИБПК СО РАН. Высушивали в комнатных условиях без доступа света до воздушно-сухого состояния. Биологически активные вещества извлекали путем последовательного экстрагирования водно-этанольными 70% (трёхкратно) и 96% (двухкратно) растворами. Экстракты объединяли, упаривали на роторном испарителе до водной фракции, которую высушивали на лиофильной установке. Полученный сухой экстракт хранили в вакуумной упаковке в комнатных условиях без доступа света
.Эксперимент проводился в условиях стандартного вивария, где мышам предоставлялись вода и корм в свободном доступе. Экстракт вздутоплодника сибирского вводился перорально один раз в день в 12 часов утра. По завершении экспериментальных сроков (7 и 14 день) мыши подвергались декапитации для последующего анализа тканей печени и почек. Морфологические изменения в тканях печени и почки осуществлялось гистопатологическим исследованием с использованием аппарата EG 1150 (Leica Microsystems, Германия). Ткани и органы помещали в 10% раствор нейтрального формалина, заключались в парафин на гистологической станции. На полуавтоматическом микротоме SM2010R (Leica Microsystems, Германия) изготавливали гистологические срезы толщиной 3-5 мкм. Образцы окрашивали гематоксилином и эозином на аппарате Autostainer XL (Leica Microsystems, Германия) по следующему протоколу: Парафин из срезов удаляется с помощью ксилола 2 раза по 10 и 5 мин соответственно. Затем обрабатывается 2 раза изопропиловым спиртом (батарея спиртов, нисходящих концентраций: 96% изопропанол – 10 мин, 70% изопропанол – 5 мин.) по истечении времени ополаскивается дистиллированной водой в течении 10 мин. Следующим шагом является окрашивание гематоксилином на 5 мин. Излишек красителя отмывается 10 мин. дистиллированной водой. 1% HCL происходит дифференцировка на 10 мин. затем промывается дистиллированной водой на 10 мин. С помощью 0,5% NH3 срезы промываются 10 мин. с последующей промывкой дистиллированной водой на 10 мин. Полученные срезы докрашиваются Эозином в течении 3 мин. потом срезы промываются дистиллированной водой на 10 мин. после ополаскивается 70% изопропиловым спиртом в течении 10 мин. Срезы просветляются готовой смесью карбола в течении 15 мин. Окончательное обезвоживание срезов производится ксилолом 2 раза по 10 и 5 мин. Готовые окрашенные срезы консервируются в среде – витрогель. После высыхания направлялись на микроскопические исследования на оптическом микроскопе BX-41 (Olympus, Япония). Изучалась архитектоника тканей печени и почек, а также наличие дистрофических изменений, некрозов и воспалительных реакций.
3. Основные результаты и обсуждения
Анализ гистологических срезов почек (рис.1.). Визуализация препаратов тканей почек контрольных мышей (без введения экстракта Phlojodicarpus sibiricus) указывает на сохранность архитектоники почечной ткани с умеренной полнокровностью сосудов среднего и крупного калибра. Следует отметить, что в некоторых сосудах отмечались эритроцитарные стазы и сладжи, при этом структура клубочков характеризуется сохранностью и малокровностью. Эпителий канальцев не имеет значительных изменений, а в просветах канальцев присутствуют эозинофильные массы (рис.1 а). В целом, гистологическое исследование почек контрольной группы свидетельствует об отсутствии выраженных патологических изменений.
Рисунок 1 - Микрофотография почки:
а - контрольная группа; б - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 10 мг/мл; в - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 100 мг/мл; г - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 10 мг/мл; д - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 100 мг/мл
Примечание: окраска почки гематоксилин-эозином; увеличение ×10
Таким образом, полученные результаты анализа гистологических срезов тканей почки мышей в зависимости от дозы и продолжительности перорального введения экстракта Phlojodicarpus sibiricus указывают на отсутствие токсичного воздействия.
Анализ гистологических срезов печени (рис.2.). В контрольной группе отмечается фрагменты ткани с сохранной гистоархитектоникой. Портальные тракты не расширены, наблюдается рассеянная лимфоидная инфильтрация. Следует отметить, что дольки печени балочного строения, с сохранными гепатоцитами с зернистой эозинофильной цитоплазмой, ядра с зернистым хроматином и отчетливыми ядрышками. Синусоиды при этом малокровны, часть центральных вен характеризуется полнокровностью (рис.2 а).
При введении экстракта в дозе 10 мг/мл на протяжении 7 дней (рис.2 б) в печени также наблюдалась сохранная архитектоника, без значительных отклонений от нормы. Лимфоидная инфильтрация в портальных трактах была минимальной, а дольки печени сохраняли нормальную структуру. Однако отмечаются единичные дистрофические изменения в виде вакуолизации цитоплазмы и ядра с зернистым хроматином. Синусоиды и центральные вены малокровны. В группе, получавшей экстракт в дозе 100 мг/мл на протяжении 7 дней (рис.2 в), отмечались более выраженные изменения: в ткани печени наблюдались некрозы гепатоцитов, пролиферация желчных протоков и вакуолизация цитоплазмы. Несмотря на эти изменения, в основном структура ткани оставалась сохранной, а патологические изменения не носили диффузного характера.
При длительном введении экстракта (14 дней) в дозе 10 мг/мл (рис.2 г) в печени продолжает наблюдаться сохранная архитектоника. Необходимо отметить, что пролиферация желчных протоков и некрозы гепатоцитов становятся более выраженными, особенно при высокой дозировке 100 мг/мл (рис.2 д.).
Рисунок 2 - Микрофотография печени:
а - контрольная группа; б - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 10 мг/мл; в - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 100 мг/мл; г - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 10 мг/мл; д - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 100 мг/мл
Примечание: окраска печени гематоксилин-эозином; увеличение ×10
Таким образом, результаты исследования показывают, что пероральное введение экстракта Phlojodicarpus sibiricus оказывает относительно мягкое воздействие на почки и печень мышей при краткосрочном введении в дозах 10 мг/мл и 100 мг/мл. Однако длительное воздействие и увеличение дозировки приводят к более выраженным изменениям в печени.
4. Заключение
Таким образом, проведённое исследование показало, что экстракт Phlojodicarpus sibiricus оказывает значительное влияние на морфологическое состояние почек и печени белых лабораторных мышей линии ICR. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект экстракта является дозозависимым и варьируется в зависимости от продолжительности его применения. При краткосрочном введении экстракта даже в высоких дозах почки и печень сохраняли свою архитектуру с минимальными изменениями, что указывает на умеренное воздействие. Однако длительное введение экстракта, особенно в дозе 100 мг/мл, привело к более выраженным патологическим изменениям, особенно в ткани печени, где наблюдались дистрофические изменения и некрозы гепатоцитов.
Эти результаты подчеркивают потенциальную роль экстракта как биологически активного вещества с цитотоксическими свойствами при долгосрочном применении. Однако для полноценного понимания его механизмов действия и оценки безопасности необходимо проведение дальнейших исследований, включая клинические испытания и оценку возможных долгосрочных эффектов, связанных с накоплением активных компонентов в тканях организма.